慢病毒包裝

1、細胞準備：細胞傳到后，密度達到70％左右時進行轉染；

2、細胞轉染:取兩個EP管，dna檢測，一個加入Opti-MEM、質粒和包裝質粒；另一個加入Opti-MEM、lipo2000，fish檢測，然后將兩管混勻；

3、細胞孵育：將混合液逐滴加入細胞培養(yǎng)皿中，混勻后孵育；

4、收集病毒：轉染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度檢測:細胞為30%－50％時加入病毒上清液，檢測陽性細胞比例。

RNA pull down 檢測

RNA   pull down：RNA沉淀檢測，是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗方法之一。使用體外轉錄將RNA進行生物素標記，并與細胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復合物。復合物通過磁珠結合后分離，復合物純化洗脫后通過Western blot驗證檢測特性的蛋白。若篩選可能結合的蛋白通過質譜實驗進行檢測篩選。

分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。

SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，實時熒光定量pcr，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產物結合，瀘州pcr，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。

實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。

結果示例：

圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化

從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。

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