將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到纖維素濾膜上

（1） 在含有選擇性的瓊脂平板上放一張纖維素濾膜。

（2） 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上，再轉(zhuǎn)移至含有選擇性但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種（或打點）。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒的菌落。

（3） 倒置平板，于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。

（4） 用已裝防水黑色繪圖墨水的針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。

（5） 用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放于4℃，直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。

（6） 裂解細(xì)菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結(jié)合于纖維素濾膜。

結(jié)1核病是嚴(yán)重威脅人類健康的傳1染性疾病，每年約有200萬人死于該病，其死1亡率在傳1染性疾病中僅低于艾1滋病，隨著醫(yī)1療診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，結(jié)1核病病理診斷經(jīng)歷了單一形態(tài)學(xué)和聯(lián)合特殊染色，到如今利用分子病理基因檢測技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確診斷的三個階段。

　　我科早在全1國建立了系統(tǒng)性結(jié)1核病分子病理診斷技術(shù)的平臺，率1先將分子病理診斷技術(shù)在結(jié)1核病中應(yīng)用并推廣，解決了傳統(tǒng)病理對菌陰肺結(jié)1核及肺外結(jié)1核病的診斷率低、結(jié)1核病與非結(jié)1核分枝桿1菌病無法鑒別以及耐藥結(jié)1核病無法診斷等難題。同時，我科作為中華醫(yī)學(xué)會結(jié)1核病學(xué)分會金1牌病理培訓(xùn)基地，負(fù)責(zé)組織制定了結(jié)1核病病理診斷規(guī)范、培訓(xùn)了大量的專1業(yè)技術(shù)人員，為形成結(jié)1核病病理學(xué)綜合診治新模式做出了卓1越貢獻(xiàn)!

熒光原位雜交技（fish）原理：是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位。

       熒光原位雜交技（fish）實驗步驟：

       1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

       2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，植物組織RNA原位雜交測試服務(wù)，包埋。

       3、切片：石蠟經(jīng)切片機(jī)切片，攤片機(jī)撈片，62°烤箱烤片2h。

       4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-無水乙醇Ⅰ 5min-無水乙醇Ⅱ 5min，風(fēng)干，DEPC水浸泡。

       5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

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