MTT檢測

MTT 是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。

三、自噬過程進行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，細胞培養(yǎng)技術，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，細胞，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，流式細胞實驗，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，細胞增殖實驗，故也屬于非特異性的。

關于細胞培養(yǎng)的常見問題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細胞生長必需的。我們培養(yǎng)細胞時不常規(guī)使用，因為連續(xù)使用會促進耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實驗室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強烈建議好使用細胞提供機構或細胞庫推薦的生長培養(yǎng)液。有些細胞可能會適應在不同培養(yǎng)基中生長，在做好保種的條件下，可以分出部分細胞做測試。

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