單細(xì)胞RNA測序

單細(xì)胞RNA測序也稱scRNA-Seq。通常而言，一般的組織細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)會產(chǎn)生1000萬個讀數(shù)，如果一個基因的頻率超過50RPKM，即每百萬讀數(shù)中每千個堿基中超過50個，這一基因即被認(rèn)為有表達(dá)。泊松分布下，1kb長的基因有超過500個讀數(shù)和4%的小變異系數(shù)，即CV值；哺乳動物細(xì)胞通產(chǎn)含有200，000個mRNA，因此至少要用50個單細(xì)胞一起才能到達(dá)小CV值；考慮到逆轉(zhuǎn)錄的效率和環(huán)境干擾等因素，dna檢測，為得到準(zhǔn)確的表達(dá)和細(xì)胞種類的識別，需要使用的細(xì)胞數(shù)量實(shí)際要更多。

RNA提取

1.棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次1-2。

2.棄去PBS，用1000u1吸干凈殘余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管標(biāo)號與每孔相對應(yīng)備用。

5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的 EP管中國。

6.往每個EP管中加入250ul，pcr，劇烈震蕩30s， 冰上靜置12min[問l。

7. 所有樣品4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 15min.

8. 再次標(biāo)記一批同樣編號EP管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號的EP管中，再加入400ul異充

分混勻。4C冰箱35min。

10. 4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時間: 10min.

11.棄去.上清液，加1m175%乙醇，輕搖7]。

12. 4C離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測濃度。

組織RNA提取

1、剪米粒大小組織塊放入EP管中標(biāo)號。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到組織為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。

外顯子測序

外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進(jìn)行高通量測序，它能夠以相對低的費(fèi)用對人類外顯子組進(jìn)行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測序這種技術(shù)迅速紅起來。到目前為止，已有超過1萬個外顯子組被測序。

如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，實(shí)時定量pcr，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測序平臺對同一個人類血液樣品進(jìn)行分析。他們的結(jié) 果表明，NimbleGen平臺作為一個使用高密度重疊探針的平臺，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測小的變異時所需的測序量也少。在同樣獲得80M測序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測序和全基因組測序（WGS），顯示外顯子組測序能夠檢測到WGS錯過的小變異。

除了文中提到了三個主流平臺，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。

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