干細(xì)bao培養(yǎng)誘導(dǎo)分化

     干細(xì)bao是一類具有自我更新、高度增殖和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，理論上具有分裂能力，在特定條件下，可分化成特定組織。通常改變抑制 ES 細(xì)胞不分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件， ES 細(xì)胞就可以分化成多種細(xì)胞類型。ES 細(xì)胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學(xué)特性，使其廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域， 它的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值已成為世界范圍內(nèi)研究的熱點(diǎn)。目前，已報(bào)道的自ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞主要包括胰島細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟gu細(xì)胞和黑素細(xì)胞等。

大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整zhu射麻zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動(dòng)脈，以無(wú)菌的冷Hank液漱朱洗血.同時(shí)剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白，取出雙shen冰浴保存。

(2)shen小球分離:參照Green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm"的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過(guò)80.120和200目鋼篩。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培養(yǎng)；將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。

軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗(yàn)基本步驟:

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活l細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血l清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，置入37回5%CO2溫箱中培養(yǎng)10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫l瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過(guò)40日。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過(guò)35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗(yàn)。

軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克l隆)

將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個(gè)孔1.4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，西安細(xì)胞，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，Spotll 采集圖像。

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