細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過程，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)?；靹蚝笫褂昧姿徕}轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測(cè)病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測(cè)：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無(wú)推薦MOI，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包費(fèi)用，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，臺(tái)州細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測(cè)；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見問題:

Q: 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)碎片如何處理？

A: 貼壁細(xì)胞在移除原培養(yǎng)液后，用 PBS 沖洗 2-3 遍；懸浮細(xì)胞離心移除原培養(yǎng)液后，加入 PBS 重懸，離心移除 PBS; 一般建議重復(fù)上述步驟 2-3 遍，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司，用 800-1000rpm 離心 3-5 分鐘。

Q：細(xì)胞凍存能放在 -80℃ 保存嗎？

A：長(zhǎng)期保存的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)放在液氮（-196℃）中保存，短時(shí)間（一般 1 周-2 周）可以存放在 -80℃。

Q：培養(yǎng)瓶是用密封蓋好，還是用透氣蓋好？

A：都可以。只是在使用密封蓋培養(yǎng)瓶時(shí)，瓶蓋旋至約 2/3，不要完全擰緊，預(yù)留約 1/3 以便細(xì)胞可以透氣；有些品牌的密封蓋培養(yǎng)瓶的瓶蓋上有適合位置指示標(biāo)志。

Q:何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS?

A: Fetal bovine serum(FBS)和 Fetal Calf Serum(FCS)之間沒有區(qū)別，都是指胎牛；FCS 不是正規(guī)命名，盡量不使用。Calf Serum（CS）則是指小牛。Horse Serum(HS)則是指馬。

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