小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長(zhǎng)分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細(xì)胞形成13天TRAP( )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開(kāi)始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，陷窩面積呈增加趨勢(shì);破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時(shí)開(kāi)始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.

Q:中的沉淀物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么影響？

A:（1）細(xì)胞生長(zhǎng)，我們的試驗(yàn)以及經(jīng)驗(yàn)表明沉淀物不會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)，我們的客戶(hù)以及其它生產(chǎn)商也證明了這一點(diǎn)。

（2）過(guò)濾，如果中出現(xiàn)大量的沉淀物，將很難過(guò)濾。一般說(shuō)來(lái)，因?yàn)樵谏a(chǎn)工序中已經(jīng)過(guò) 100nm 或者 40nm 的過(guò)濾處理，并且經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的無(wú)菌檢測(cè)，因此不推薦再過(guò)濾用于細(xì)胞培養(yǎng) 的。在實(shí)驗(yàn)室中沒(méi)有必要再過(guò)濾處理，在大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)中往往將直接加到培養(yǎng)基中一起 過(guò)濾。

（3）污染，磷酸鈣往往被誤認(rèn)為微生物污染而引起。研究者可能會(huì)在中觀察到一些絮狀的 沉淀，因此就會(huì)比較警覺(jué)的去做無(wú)菌試驗(yàn)，將放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會(huì)觀察到更多的絮狀 沉淀，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包哪家好，因此就斷定被污染了。并且當(dāng)研究者將樣品放在倒置顯微鏡下觀察時(shí)往往可以看到一些可 以運(yùn)動(dòng)的小黑點(diǎn)，因此就更加確認(rèn)是被污染了。于是，研究者就會(huì)花費(fèi)更多的時(shí)間和精力來(lái)和生產(chǎn)商 確認(rèn)，但終確定沒(méi)有被污染而只是沉淀。為了避免這些問(wèn)題的發(fā)生，我們建議不要直接將放在 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將加到瓊脂板上進(jìn)行培養(yǎng)以觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。另外，也可以進(jìn) 行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)是否有污染。

成纖維細(xì)胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺(tái)中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開(kāi)，用另外- -組剪刀、鑷子剪開(kāi)腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。

3. 用200 μ的移液反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。

4.將上層細(xì)胞懸液倒入一個(gè)裝有10 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，以1500 rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，再用30 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細(xì)胞沉淀用15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細(xì)胞)。

6. 3x106細(xì)胞懸浮于15 ml MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

8.細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，作者- -般不超過(guò)五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細(xì)胞再次長(zhǎng)到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家-細(xì)胞實(shí)驗(yàn)-英瀚斯(查看)由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是一家從事“組織病理,細(xì)胞生物,分子生物學(xué)平臺(tái),動(dòng)物模型科研外包服務(wù)”的公司。自成立以來(lái)，我們堅(jiān)持以“誠(chéng)信為本，穩(wěn)健經(jīng)營(yíng)”的方針，勇于參與市場(chǎng)的良性競(jìng)爭(zhēng)，使“英瀚斯”品牌擁有良好口碑。我們堅(jiān)持“服務(wù)至上，用戶(hù)至上”的原則，使英瀚斯在技術(shù)合作中贏得了客戶(hù)的信任，樹(shù)立了良好的企業(yè)形象。 特別說(shuō)明：本信息的圖片和資料僅供參考，歡迎聯(lián)系我們索取準(zhǔn)確的資料，謝謝！