體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有10%的Cdc42被激l活，而在體外用GTPγS處理大約有90%的Cdc42被激l活。

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入0.5 mL的細(xì)胞提取物（如果是純的Cdc42蛋白則每個(gè)管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個(gè)管中加入20ul 0.5M EDTA(終濃度即為20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入5ul的100X GTPγS（終濃度即為100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加入5ul的100X GDP（終濃度即為1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于30°C條件下反應(yīng)30min并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為60mM)。

分析原理

基于構(gòu)型特異性抗Gα13-GTP的NewEast生物科學(xué)Gα13活化檢測(cè)試劑盒從細(xì)胞提取物或體外檢測(cè)活性Gα13-GTP水平的單克l隆抗l體GTPγS負(fù)載Gα13活化試驗(yàn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，抗活性Gα13小鼠單克l隆抗l體用含有Gα13-GTP的細(xì)胞裂解液培養(yǎng)。結(jié)合的活性Gα13將被蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l體免l疫印跡法檢測(cè)沉淀的活性Gα13。

Gα13活化試驗(yàn)。MEF細(xì)胞分別用LPA（第2道）或不加LPA（1道）處理。細(xì)胞裂解物用抗活性Gα13單克l隆抗l體（Cat）孵育。#26902）（頂面板）。G蛋白活性檢測(cè)試劑盒。這個(gè)用抗Gα13兔多克l隆抗l體（Cat）免l疫印跡法檢測(cè)沉淀活性Gα13#21005年）。底部的面板顯示了用抗Gα13的細(xì)胞裂解物的Western blot（5%在頂部面板中使用的）。

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