檢測步驟

Ι。活性Cdc42 Pull-Down實驗

1. 等分0.5-1 mL的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克l隆抗l體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°C條件下孵育1H，并輕輕的進(jìn)行搖動。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。

試劑盒成分

特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克l隆抗l體（Anti-active Cdc42， Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的疊氮l化鈉。此抗l體可以特異性識別所有脊椎動物中的Cdc42-GTP。

Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時溶液需要充分混勻，再吸?。?/p>

5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0)，     750 mM NaCl， 50 mM MgCl2， 5 mM EDTA， 5% Triton X-100。

特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（Anti-Cdc42，rac1-GTP， Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實驗中0.5mL細(xì)胞裂解液使用      5ul GTPγS標(biāo)記。

100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實驗中0.5mL細(xì)胞裂解液使用5ul GDP標(biāo)記。

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mM PMSF， 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個細(xì)胞），并用活性劑或抑制l劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細(xì)胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g， 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

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