核酸試劑盒

RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，反應(yīng)溫度在37°C左右。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進(jìn)行得非?？?/span>，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系(TwistAmp? Basic)含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。擴(kuò)增結(jié)果可以通過凝膠電泳進(jìn)行終點(diǎn)檢測，產(chǎn)物純化后可用于下游研究。

在這個基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，就可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用。舉例來說，TwistAmp basic代理，TwistAmp? exo結(jié)合了exo探針技術(shù)和核酸外切酶III，能實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的實(shí)時讀取，就像熒光定量PCR一樣。不過反應(yīng)終點(diǎn)的擴(kuò)增子總量有所減少，適合獲得強(qiáng)熒光信號進(jìn)行動力學(xué)分析，不適合終點(diǎn)檢測(比如跑膠)。將exo探針技術(shù)、核酸外切酶III和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合起來，可以一步實(shí)現(xiàn)RNA模板的實(shí)時擴(kuò)增。

等溫核酸試劑盒

如何提高擴(kuò)增曲線的可重復(fù)性?

優(yōu)化擴(kuò)增曲線考慮以下因素: 對于低拷貝數(shù)模板，TwistAmp basic總代理，不穩(wěn)定擴(kuò)增可能是因為達(dá)到檢測限或者是反應(yīng)混勻程度不同（未混勻的反應(yīng)擴(kuò)增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀，TwistAmp basic，也是可能導(dǎo)致不穩(wěn)定擴(kuò)增的原因。所以，20x反應(yīng)mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能，并且有效提高擴(kuò)增效率。不穩(wěn)定擴(kuò)增也可能是因為master mix量不足，在加入體系前，TwistAmp basic公司，用戶必須保證震蕩后20x反應(yīng)組分均一。

等溫核酸試劑盒

數(shù)字PCR法和熒光PCR法的關(guān)鍵區(qū)別在于檢測結(jié)果的定量和相對定量差異。據(jù)了解，現(xiàn)階段數(shù)字PCR試劑和機(jī)器相價格加高（一臺儀器近百萬元），在SARS-CoV-2快速檢測中的優(yōu)勢并不大。

不過，由于具備自動化程度更好、耗時更短等技術(shù)優(yōu)勢，國內(nèi)多家掌握了數(shù)字PCR技術(shù)的核酸試劑研發(fā)企業(yè)正在嘗試開發(fā)適用于SARS-CoV-2檢測的相關(guān)試劑盒。

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