1. VASP通過(guò)調(diào)節(jié)Rab11依賴(lài)性TGF-β受體的質(zhì)膜靶向來(lái)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的TGF-β活化

    肝l病學(xué)第61卷，首1期，第361-374頁(yè)，2015年1月

2. Rab5活性調(diào)節(jié)GLUT4分類(lèi)為胰島素反應(yīng)性和非胰島素反應(yīng)性?xún)?nèi)體室：胰島素抵抗發(fā)展的潛在機(jī)制。

    內(nèi)分l泌學(xué)。 2014年9月; 155（9）：3315-28

將裂解液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。 如果發(fā)生這種情況，Active Rac，可將裂解液通過(guò)27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

通過(guò)離心10分鐘（在4°C下為12，000 x g）清除裂解物。

收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-70°C以便將來(lái)使用。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

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懸浮細(xì)胞

1.培養(yǎng)細(xì)胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后通過(guò)離心沉淀細(xì)胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通過(guò)重復(fù)移液裂解細(xì)胞。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果這

   發(fā)生時(shí)，裂解液可通過(guò)27?號(hào)注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組DNA。

8.通過(guò)離心10分鐘（在4°C下為12，000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°C以備將來(lái)使用。

陽(yáng)性和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

    注意：體內(nèi)刺激細(xì)胞會(huì)激l活大約10％的可用Rab35，而

    體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活近90％的Rab35。

1.將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Rab35蛋白）。

2.向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM終濃度）。

3.將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4.在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5.在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6.通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。

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