tunel流式細胞凋亡檢測服務(wù)通常稱為細胞程序性死1亡，是由基因控制的主動性細胞死1亡過程。越來越多數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡與多種疾病密切相關(guān)，如癌細胞具有連續(xù)增殖、抵抗細胞凋亡能力，利用流式細胞儀分析細胞凋亡可為腫1瘤診斷，療1效評價和預(yù)后預(yù)測提供了重要的參考指標。

　　TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，其原理是生物素biotinylate標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結(jié)合，后者又與POD底物H2O2、二氨1基聯(lián)1苯1胺（DAB）產(chǎn)生深棕色反應(yīng)，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫1瘤藥的藥1效評價，以及通過雙色法確定細胞類型和分化階段。

阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%1甲1醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針has-circ-ST6GALNAC6 probe 雜交液，濃度6ng/ul，恒溫箱37度雜交過夜。

雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

滴加封閉液：滴加封閉血1清（正常兔血1清），室溫30min。

滴加鼠抗地1高辛標記過氧化物酶（anti-DIG-HRP）：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育50min，后PBS洗3次×5min。

        

后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

  原位雜交的預(yù)雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。

   雜交——按每張切片20μι雜交液，植物葉片原位雜交技術(shù)服務(wù)，加在切片上。將原位雜交專1用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

        

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