武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國生命科學試劑供應商美國NewEastBio在中國的子公司。公司位于武漢東湖高新技術開發(fā)區(qū)光谷生物城.美國NewEastBio專注于生命科學和生物技術領域，主要產品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長期穩(wěn)定的合作關系，產品銷往全球。

懸浮細胞

1.培養(yǎng)細胞并根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進行細胞計數(shù)，然后通過離心沉淀細胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細胞沉淀物中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每1 x 107個細胞0.5 – 1 mL）。

5.通過重復移液裂解細胞。

小G蛋白是從屬于細胞調節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動過程中其分子結構會呈現(xiàn)出2種相互轉換的形式：與GTP結合的激l活狀態(tài)和與GDP結合的非活性狀態(tài)。

目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結合區(qū)域（PBD）結合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學功能，進而間接的進行Cdc42活性l功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結合蛋白與p21結合區(qū)域之間較低的親和力，導致這種檢測方法的重復性較差。

試劑盒成分

特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克l隆抗l體（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的疊氮l化鈉。此抗l體可以特異性識別所有脊椎動物中的Cdc42-GTP。

Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時溶液需要充分混勻，再吸?。?

5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

特異性識別Cdc42活性構象的兔多克l隆抗l體（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗l體濃度是1mg/ml)，抗l體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實驗中0.5mL細胞裂解液使用      5ul GTPγS標記。

100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實驗中0.5mL細胞裂解液使用5ul GDP標記。

儲存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內不提供，由實驗者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免l疫印跡相關試劑；

8.  免l疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測試劑；