ELISA 是一種結(jié)合抗原、抗ti特異性反應(yīng)和酶對(duì)底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。相對(duì)于傳統(tǒng)芯片而言，RNA-Seq無需預(yù)先設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)物種的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測(cè)，能夠提供較的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的良好工具。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗ti既保留其免yi學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應(yīng)，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗ti，通過反應(yīng)使其結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

miRNA測(cè)序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油。microRNA通過和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測(cè)序技術(shù)。染色質(zhì)免l疫共沉淀技術(shù)(ChIP)基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免l疫沉淀分析Chromatinimmunoprecipitationassaykit,ChIP)技術(shù)可以真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。基于第二代測(cè)序技術(shù)的miRNA測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。

RNA提取處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時(shí)以上。

3.引物的OD數(shù)如何定量？

答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測(cè)定的：用紫外分光光度計(jì)，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測(cè)定溶液的光密度。凝膠掃描及圖像分析(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Imagescanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。測(cè)定時(shí)溶液的光密度好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測(cè)OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。

4.需要什么級(jí)別的引物？

答：引物常用的純化方式脫鹽、BioRP / OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，確定訂購引物的純度級(jí)別。