間接標記的方法中應用了報告分子標記的探針，報告分子通過親和酶促的方法進行顯色。常用的報告分子如地高6辛，生物素。結合地高6辛抗6體或鏈霉親和素上耦聯(lián)的酶系統(tǒng)進行間接的底物反應檢測。地高6辛標記核酸的歷史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黃的花和葉中特有的成分，檢測時使用的地高6辛抗6體不會結合于其他的生物分子。這是相較于生物素標記系統(tǒng)的優(yōu)勢。地高6辛抗6體上可耦聯(lián)堿性磷酸酶、過氧化酶，及熒光分子和膠體金等，根據不同的應用需求，呈現(xiàn)高信噪比的核酸檢測結果。但需注意，由于引入了免6疫檢測反應，在放大檢測靈敏度的同時，應注意樣品內源性酶的滅活，以降低檢測背景。

通過不同標記方法的聯(lián)合應用，還可在同一樣本中實現(xiàn)染色體不同區(qū)域或細胞樣本中不同RNA序列的多重檢測。

原位雜交 (ISH) 是用于定位固定組織和細胞中特定核酸靶標的強大技術，能夠獲得與基因表達和遺傳位點相關的時間和空間信息。 雖然ISH的基本工作流程與印跡雜交近似，即核酸探針被合成、標記、純化和特異性靶標退火，但其不同之處在于前者可通過可視化顯示組織內的結果來獲得更多信息。 如今有兩種基本方法來實現(xiàn)可視化顯示原位RNA和DNA靶標，即熒光 (FISH) 和顯色 (CISH) 檢測。 每種檢測方法本身的特點（見下表）使得FISH和CISH適用于截然不同的應用。 雖然兩種方法均使用標記的、與樣本雜交的靶標特異性探針，但每種方法用于可視化顯示樣本的儀器不同。 這里我們將強調每種方法的不同之處和各自的優(yōu)勢。

武漢思特進科技發(fā)展有限公司成立于2007年，是一家以實驗技術研發(fā)、實驗產品研發(fā)、日化產品研發(fā)、實驗項目承接為一體的高新技術公司；公司實驗中心有分子生物學平臺、細胞平臺、光鏡平臺、植物組培平臺、原核蛋白表達平臺、日化產品生產平臺；可以開展各類動、植物、細菌、細胞等生物實驗。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。



根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。