水中微生物DNA提取試劑盒，樣本制備步驟。

步驟1. 樣本過濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準備：預(yù)先將恒溫儀設(shè)置到70℃，將恒溫箱設(shè)置到37℃。

2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉(zhuǎn)放置到試劑盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400μl裂解液轉(zhuǎn)移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分鐘。

2.6 樣本短暫離心，并加入400μl Binding Buffer（結(jié)合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請勿離心樣本，并立即進行下一步。

步驟3. DNA提取

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800μl）轉(zhuǎn)移到CollectionTube（收集管）內(nèi)的SpinColumn（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000× g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個新的收集管中。

3.5 zui大速度離心3分鐘，病毒核酸純化，以去除殘留的洗液2。

3.6 棄掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃預(yù)熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應(yīng)全部覆蓋洗脫液。

3.8 室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9 樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲存在2~8℃，可存放1周。長期儲存是在≤-18℃。

DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：

　　NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性， 使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合.

適用于ＰＣＲ研究的快速提取法：

1 田間剪取植株新鮮葉片5-10ｍｇ(約2ｃｍ長)左右，新鮮葉片放于1 5ｍｌ離心管中，存于冰盒中，根據(jù)樣品號貼上相應(yīng)的標簽。

2 用剪刀將葉片組織剪細(約0 5ｃｍ長)放在點穴式研板中。

3 加入400μｌＤＮＡ提取緩沖液，用玻棒將葉組織研細，直到液體變成深綠色即可。

4 再加400μｌＤＮＡ提取緩沖液，混合均勻，轉(zhuǎn)入一新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應(yīng)的編號)。

5 加400μｌ氯1仿，混合均勻后，2400×ｇ離心30ｓ，將上清液轉(zhuǎn)入一支新的1 5ｍｌ離心管(貼上相應(yīng)的編號)。

6 加800μｌ無水乙醇，混勻，2400×ｇ離心3ｍｉｎ。棄上清。

7 70%乙醇沖洗，風(fēng)干。

8 用50μｌＴＥ緩沖液溶解，存于-20℃。

9 取1μｌ用于ＰＣＲ分析。

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