基因分型

PCR可用于檢測(cè)特定細(xì)胞或生物體中等位基因的序列差異。例如，基因敲除和敲入小鼠等生物的基因分型[3]。引物對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)位于目標(biāo)區(qū)域側(cè)翼，可根據(jù)是否存在擴(kuò)增子及擴(kuò)增子長(zhǎng)度來檢測(cè)遺傳變異。

但是如果為了檢測(cè)特定核苷酸突變，則必須對(duì)擴(kuò)增的序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如， PCR擴(kuò)增子測(cè)序就是研究單核苷酸變異（SNVs）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）的方法之一。強(qiáng)烈推薦使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR過程中引入多余的突變。

通過PCR進(jìn)行基因分型也是對(duì)癌1癥和遺傳病中的 突變進(jìn)行遺傳分析的一個(gè)基本方式。

競(jìng)爭(zhēng)性PCR(competitive PCR， c-PCR技術(shù)

c-PCR技術(shù)是競(jìng)爭(zhēng)cDNA模板與目的cDNA同時(shí)擴(kuò)增.使用同樣的引物，但一經(jīng)擴(kuò)增后。能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競(jìng)爭(zhēng)cDNA模板.其序列與目的cDNA序列相同.不過模板中僅有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn)突變性的cDNA模板可用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解，并用分光計(jì)測(cè)定其濃度。cDNA目的序列和競(jìng)爭(zhēng)模板相對(duì)應(yīng)的含量.可用澳化乙錠染色.電泳膠直接掃描進(jìn)行測(cè)定或摻入放1射性同位素標(biāo)記的方法測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)模板開始時(shí)的濃度是已知的.則cDNA目的序列的zui初濃度就能測(cè)定。這種方法能準(zhǔn)確測(cè)定mRNA中cDNA靶序列.可用于幾個(gè)到10個(gè)細(xì)胞中mRNA的定量。

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，含基因組DNA去除試劑盒，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

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