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RNA病毒檢測(cè)試劑盒用于定性檢測(cè)和分析RNA病毒和RNA分子,特別適合檢測(cè)病毒等此類(lèi)病毒。
組分1. ConviFlex? RT-Taq Mix的凍干粉包含:MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶及dNTP。
其中MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶,來(lái)自小鼠白血1病病毒(M-MuLV)并經(jīng)過(guò)基因修飾。
這里的Taq聚合酶另兼具熱啟動(dòng)功能。
此Taq酶在室溫下,活性被抗1體所抑制,當(dāng)溫度達(dá)到70°C以上時(shí),才會(huì)被完全激1活。
在70°C 以下時(shí),由于Taq酶沒(méi)有完全活化,因此實(shí)驗(yàn)不會(huì)產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體。熱啟動(dòng)Taq酶的使用可使PCR具有更高的特異性和靈敏度。
DNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理
溶液I—溶菌液:
溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí),核酸提取,溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA:
(1)螯合Mg2 、Ca2 等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基);
(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
在選用支原體PCR法檢測(cè)來(lái)替代藥典方法時(shí),需要考慮如下兩個(gè)方面:
首先一步是要使用符合歐洲藥典要求,經(jīng)過(guò)全方面驗(yàn)證的支原體檢測(cè)試劑盒,第二部是自我驗(yàn)證,即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對(duì)于該試劑盒方法是合適的,并且操作過(guò)程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗(yàn)證通常需要采用三個(gè)不同批次的試劑盒,然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品,做復(fù)孔(通常是8個(gè)復(fù)孔),并且至少選擇3個(gè)支原體物種進(jìn)行驗(yàn)證。
有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會(huì)提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值,以方便二者的換算。因?yàn)?0CFU只能確定PCR能夠達(dá)到的檢測(cè)限在10CFU以下,但無(wú)法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進(jìn)一步確定檢測(cè)限的數(shù)值。
總之,PCR方法很有用,但需要避免假陰性,驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、無(wú)模板對(duì)照和內(nèi)控對(duì)照,以保證PCR反應(yīng)正常,以及支原體少量存在時(shí)確實(shí)能檢出來(lái),支原體不存在時(shí)也確保是結(jié)果陰性,從而使得PCR方法在工業(yè)應(yīng)用時(shí)能確保zui終結(jié)果的可靠。
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