pcr實(shí)驗(yàn)室病原體測定

PCR技術(shù)的問世使病原體檢測能夠快速、方便地進(jìn)行。由于PCR技術(shù)假陽性率太高，只要有微量病原體存在就可得到陽性結(jié)果，這并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義。因此，對(duì)模板準(zhǔn)確定量顯得特別重要，PCR實(shí)驗(yàn)室凈化設(shè)計(jì)，應(yīng)用熒光技術(shù)PCR就能夠快速、準(zhǔn)確地得到結(jié)果。對(duì)于解決學(xué)檢測的“窗口期”問題，判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)，以及檢測不能判定是現(xiàn)癥還是既往時(shí)，均可利用PCR進(jìn)行確定。

示例：新型冠狀病毒核酸檢測。

方法學(xué)：熒光PCR法。

用途：用于體外定性檢測新型冠狀病毒的疑似病例、疑似聚集例患者、其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒診斷或鑒別。

檢測基因：新型冠狀病毒（2019-nCoV）ORFlab和N基因、E基因。

標(biāo)本類型：上呼吸道標(biāo)本：咽拭子、鼻拭子；下呼吸道標(biāo)本：呼吸道抽取物、肺泡灌洗液樣本、肺組織活檢標(biāo)本。

檢測流程：

（1）核酸檢測前的生物安全防護(hù)（工作人員個(gè)人三級(jí)防護(hù)的穿戴）→（2）樣本的滅活（56℃滅活30分鐘）→（3）樣本的核酸提?。ㄊ止ぁ⒑怂崽崛x）→（4）PCR體系的配制和模板加樣→（5）上機(jī)檢測及結(jié)果分析→（6）檢測后的消毒。

其他病原體檢測：HIV、甲乙丙肝、HPV、肺支、肺衣、EB病毒、腺病毒、胞病毒、甲乙流、埃博拉病毒、B族鏈球菌。

適合開展的醫(yī)院和：兒童醫(yī)院、婦幼、兒檢所、第三方、各種級(jí)別的有需求的醫(yī)院。

pcr輔料質(zhì)檢的基本原則

輔料的質(zhì)檢通常是在新一批的輔料到實(shí)驗(yàn)室后統(tǒng)一做一次或者定期（半年或1年）做，因此質(zhì)檢就包含了驗(yàn)貨和質(zhì)檢2個(gè)部分。由于輔料的質(zhì)檢沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一般由各實(shí)驗(yàn)室自行制定，可簡可繁，這里提出一些方法供大家參考和批評(píng)指正。

1.外包裝檢查：外包裝應(yīng)完整無損無污，常德PCR實(shí)驗(yàn)室凈化，標(biāo)識(shí)清楚，檢查品名、品牌，貨號(hào)，規(guī)格、生產(chǎn)日期，有效期、保存條件等信息。

2.內(nèi)包裝檢查：內(nèi)包裝物品應(yīng)與外包裝標(biāo)識(shí)一致，檢查是否有破損，泄漏，內(nèi)容物是否齊全，是否有相應(yīng)的使用說明書等。

3.性能質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否與其性能一致，比如吸頭的準(zhǔn)確性和氣密性等

4.污染物質(zhì)檢：檢測試劑耗材是否被常規(guī)檢測項(xiàng)目的待檢物污染，這種污染可能是物品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，也可能是運(yùn)輸或?qū)嶒?yàn)室的保存過程中被污染。

5.抑制物質(zhì)檢：檢測試劑耗材中是否存在PCR反應(yīng)的抑制物，比如核酸酶。

需要注意以下問題：

實(shí)驗(yàn)室使用的基因擴(kuò)增儀，熒光定量PCR儀都是高精度儀器。一旦儀器出現(xiàn)一些溫度或者檢測上的小偏差，則很可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。因此，學(xué)會(huì)日常保養(yǎng)和維護(hù)是尤為重要的。

1、儀器安置

儀器應(yīng)安放在濕度較低、灰塵較少并遠(yuǎn)離水源和熱源的地方，無腐蝕性氣體或強(qiáng)磁場干擾。

環(huán)境溫度建議在18~35℃之間。儀器之間應(yīng)保持50cm 以上距離，降低儀器之間的影響。

2、樣品臺(tái)、熱蓋定期清潔

用95%乙醇配合棉簽、無塵布等工具，清潔樣品臺(tái)。之后運(yùn)行PCR儀，設(shè)定保持溫度為50℃，約5~10min，讓殘余液體揮發(fā)去除。另外，熱蓋也應(yīng)該用酒精或純水定期清洗，PCR實(shí)驗(yàn)室凈化方案，確保熱蓋清潔，溫控性能良好。對(duì)于熒光定量PCR，清潔樣品臺(tái)和熱蓋的同時(shí)，去除灰塵等雜物，保證光路清潔，降低信號(hào)干擾。

3. 使用前預(yù)熱

老款的PCR儀的性能比不上新款儀器，使用前需要進(jìn)行預(yù)熱，不僅對(duì)儀器維護(hù)有好處，還能節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。新款的儀器升溫快，但還是建議能在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前預(yù)熱2min，這樣可以有效延長儀器的使用壽命。

4. 定期運(yùn)行維護(hù)

1.PCR儀器需要定期檢測，視制冷方式而定一般半年至少一次。

2.PCR反應(yīng)的要求溫度與實(shí)際分布的反應(yīng)溫度是不一致的，PCR實(shí)驗(yàn)室凈化裝修，當(dāng)檢測發(fā)現(xiàn)各孔平均溫度差偏離設(shè)置溫度大于1～2℃時(shí)，可以運(yùn)用溫度修正法糾正PCR實(shí)際反應(yīng)溫度差。

3.PCR反應(yīng)過程的關(guān)鍵是升、降溫過程的時(shí)間控制，要求越短越好，當(dāng)PCR儀的降溫過程超過60s，就應(yīng)該檢查儀器的制冷系統(tǒng)，對(duì)風(fēng)冷制冷的PCR儀要較地清理反應(yīng)底座的灰塵；對(duì)其他制冷系統(tǒng)應(yīng)檢查相關(guān)的制冷部件。

4.一般情況如能采用溫度修正法糾正儀器的溫度時(shí)，不要輕易打開或調(diào)整儀器的電子控制部件，必要時(shí)要請(qǐng)人員修理或利用儀器電子線路詳細(xì)圖紙進(jìn)行維修。

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