限制性內(nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的酶切片段數(shù)與切口數(shù)一致。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切口的數(shù)目;從片段遷移率可判斷酶切片段大小。用已知分子量的線狀DNA 為對(duì)照，通過(guò)電泳遷移率的比較，可以粗略地測(cè)出分子形狀相同的未知DNA的相對(duì)分子大小。

　　質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量(Mr )一般在106～107 范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106 ，在細(xì)胞內(nèi)有三種構(gòu)型：①共價(jià)閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在;②如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫作開(kāi)環(huán)DNA;③雙鏈線狀DNA由于兩條鏈的切口在同一部位被切斷，不能成環(huán)，完全開(kāi)放成線狀，簡(jiǎn)稱線性DNA。如果要測(cè)定質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子量，建議把質(zhì)粒用單一切口的酶水解得到線性DNA部分片段。三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA 在電泳時(shí)的泳動(dòng)速度為：共價(jià)閉環(huán)DNA>線狀DNA >開(kāi)環(huán)DNA。

質(zhì)粒載體和外源ＤＮＡ中限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)

    如今，質(zhì)粒載體中限制酶切位點(diǎn)的種類極為繁多，因而通常都有可能找到某種帶限制酶切位點(diǎn)恰恰與外源ＤＮＡ部分片段本身毫無(wú)二致的載體。這就具備一個(gè)不可1比擬的優(yōu)點(diǎn)，也應(yīng)是可以用相應(yīng)的限制酶消化重組質(zhì)粒崦回收外源ＤＮＡ。另一種方案，則是把片段插入到載體中能產(chǎn)生匹配末端的任何位點(diǎn)中。例如，識(shí)別不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ產(chǎn)生具有相同突出末端的限制酶切片段，這樣用BglⅡ消化而制備的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的質(zhì)粒中。這通常會(huì)使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制備載體的任何一種酶所切開(kāi)。然而很多清況下，用切點(diǎn)位于多克1隆序列側(cè)翼的限制酶進(jìn)行消化，可將片段從重組質(zhì)粒中摘出。偶爾在質(zhì)粒的以及外源ＤＮＡ兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，內(nèi)切酶，不可能找到“門當(dāng)戶對(duì)”的搭配關(guān)系。這時(shí)可用下面兩種方案加以解決：

   1）在線狀質(zhì)粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接頭或銜接頭。

   2）在得到控制的反應(yīng)條件下，用大腸桿1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分補(bǔ)平帶3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所討論，這樣?？梢允鼓切┎幌嗥ヅ涞南拗泼盖形稽c(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端，從而促進(jìn)載體和外源ＤＮＡ的連接。因?yàn)椴糠盅a(bǔ)平的反應(yīng)消除了同一分子兩端彼此配對(duì)的能力，故連接反應(yīng)過(guò)程中環(huán)化和自身寡聚化的機(jī)會(huì)也會(huì)有所降低

藍(lán)白斑篩選鑒定

　　用于克1隆的酶還須通過(guò)額外的質(zhì)量鑒定――藍(lán)白斑篩選鑒定，以確定經(jīng)酶過(guò)量消化后DNA末端的完整性。該種鑒定方法為：用酶10倍過(guò)量消化適當(dāng)?shù)妮d體上lacZ基因中單一的酶切位點(diǎn)，連接，轉(zhuǎn)化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、連接和表達(dá)b-galactosidase可以說(shuō)明克1隆后基因是完整的，一個(gè)完整的基因產(chǎn)生藍(lán)斑，一個(gè)不完整的基因(例如，降解的DNA末端)產(chǎn)生白斑。在進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定中，所有的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的白斑數(shù)量不應(yīng)超過(guò)3%。

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