使用分支DNA信號擴增的RNA FISH

Invitrogen? ViewRNA?和PrimeFlow?檢測是使用分支DNA信號擴增 (bDNA) 來檢測特異性信號的直接熒光RNA ISH方法。 使用獨立但兼容的信號擴增系統(tǒng)讓RNA靶標的多重復用成為可能。 熒光RNA原位雜交檢測分為四個主要步驟：樣本制備、靶標雜交、信號擴增以及檢測。 該方法可實現(xiàn)更高的特異性，更低的背景值和更高的信噪比。

雜交技術zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（Tm-30℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即zui適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。

zui適復性溫度（Optimunm renaturation temperature， TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

原位雜交組織（或細胞）化學技術簡稱原位雜交（In situ hybridization， ISH）是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織細胞內(nèi)待測的核酸，按堿基互補配對原則進行特異性結合，形成雜交體，原位雜交，然后用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免3疫組織化學方法在核酸原有位置進行細胞內(nèi)定位、定性和定量研究。為分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及有關細胞5因子的調(diào)控提供了有效的工具?？梢暈榻M織化學與免3疫組織化學的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護組織和細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態(tài)。

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