原位雜交；原位雜交（in situ hybridization）將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交！

使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。

以菌落原位雜交為例：對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克8隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝5酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應(yīng)不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應(yīng)時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時間為21h，那么對于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8，雜交完成了。對標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。



總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗，要獲得較滿意的敏感性，染色體原位雜交，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放0射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。



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