成纖維細胞分離方法

1.處死孕鼠，廣東細胞，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。

3. 用200 μ的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，動物細胞培養(yǎng)，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

磁性細胞標記方式

應用MACS技術進行磁性細胞分選重要的一點是高質量的標記。要盡可能地增強陽性細胞的標記，并減弱背景染色。有兩種基本的磁性標記方式:直接標記和間接標記。

1、直接磁性細胞標記(Direct magnetic cell labeling)

(磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞)直接標記是快速、zui特異的磁性標記方法。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長類細胞的MACS直標微珠可供選用。

2、間接磁性細胞標記(Indirect magnetic cell labeling )

(磁珠結合不需要的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞)間接磁性細胞標記需要聯(lián)合使用單ke隆或者多ke隆抗ti和MACS間標微珠。未結合抗ti、生物素化抗ti或者熒光素標記抗ti均可作為一抗標記細胞，再使用抗免yi球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標記細胞。幾乎針對任何種系任何細胞的任何一種單抗或多抗，均可用于間接標記。間接標記主要在如下情況時選用:當沒有直標磁珠時;需要用幾種抗ti的混合物同時分選或去除多種類型的細胞;間接標記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達弱的目的細胞時使用;使用自備或者配體的磁珠分選中。( -般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。)

骨sui內皮祖細胞的分離培養(yǎng)

方法:使用密度梯度離

心法汲差速貼壁法聯(lián)合的方法培養(yǎng)內皮祖細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)變化，癌細胞，使用Dil標記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標記的荊豆凝集素1雙熒光染色、流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD133 表達情況.結果與結論:培養(yǎng)前4 d細胞增殖不明顯第5~10天迅速增殖，并可見細胞集落及線狀結構形成培養(yǎng)第7天的內皮祖細胞具有吞噬Dil標記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標記的荊豆凝集素1的功能流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)第十天的細胞，CD133 細胞占19.2%，CD34 細胞占28.7%，CD34 /CD133 細胞占19.1%.說明密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法可在體外有效分離培養(yǎng)大鼠骨sui內皮祖細胞.

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