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取材與標(biāo)本固定
1. 取材 對(duì)于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮,為了防止RNA的降解,取材要迅速,取材后要盡快固定或冷凍保存。
2.固定 進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)固定處理,固定的目的是為了①保持細(xì)胞形態(tài)原有結(jié)構(gòu);②保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平;③使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織內(nèi)。
3.固定液 常用固定液有10%甲醛、4%多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)因此要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,選擇的固定液。
4.固定方法 組織標(biāo)本取材后,迅速放入固定液中2~4h,取材組織大小為1cm×1cm×0.5cm,不宜太大。必要時(shí),動(dòng)物組織可進(jìn)行灌流固定,然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中,4℃過(guò)夜,次日可行冰凍切片。
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例如,對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置,對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布;與細(xì)胞RNA的雜交可分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外,原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
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