細(xì)胞傳代培養(yǎng)

操作步驟

1.將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)zhen孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1- -3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，細(xì)胞，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，流式細(xì)胞檢測結(jié)果分析，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

附:消化液配制方法:

稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無Ca2 、Mg2 的Hank"s液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存，用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達(dá)0.02%。

軟gu細(xì)胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺(tái)，剔除關(guān)節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，防止軟gu組織被風(fēng)干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，細(xì)胞生物學(xué)，將細(xì)小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min，收集細(xì)胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細(xì)胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細(xì)胞生長情況并拍照保存。

細(xì)胞增殖檢測

     本公司應(yīng)用MTT比色法， 檢測細(xì)胞存活和生長。其檢測原理為huo細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶能催化外源性無色的MTT形成藍(lán)色的結(jié)晶Formazan，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的Formazan，原代細(xì)胞，用酶聯(lián)mian疫檢測儀在一定波長處測定其光吸收值，可間接反映huo細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

     該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫liu藥wu篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、以及腫liu放she敏感性測定等。服務(wù)內(nèi)容      1. 細(xì)胞接種：收到客戶細(xì)胞后，我們會(huì)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，得出細(xì)胞懸液濃度。計(jì)算出應(yīng)稀釋的倍數(shù)，按MTT試劑盒要求在96孔板內(nèi)接種 相應(yīng)濃度的細(xì)胞懸液；

     2. 細(xì)胞培養(yǎng)：然后在無菌恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)接種好的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)；  

     3. yao物處理并呈色：按不同濃度梯度加入yao物作用細(xì)胞；

     4. 溶解，比色：加入MTT檢測試劑，按操作要求孵育相應(yīng)時(shí)間，在mei標(biāo)儀內(nèi)檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光值。并處理數(shù)據(jù)得出比色結(jié)果。

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