三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長，不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

軟gu細(xì)胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺(tái)，剔除關(guān)節(jié)周圍附著的軟組織，打開髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu組織，置入裝有PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿，單細(xì)胞測(cè)序，防止軟gu組織被風(fēng)干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，細(xì)胞，將細(xì)小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min，收集細(xì)胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細(xì)胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細(xì)胞生長情況并拍照保存。

小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時(shí)間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測(cè)，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對(duì)破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細(xì)胞形成13天TRAP( )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陷窩面積呈增加趨勢(shì);破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時(shí)開始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.

單細(xì)胞測(cè)序-細(xì)胞-南京英瀚斯(查看)由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。行路致遠(yuǎn)，砥礪前行。南京英瀚斯生物科技有限公司致力成為與您共贏、共生、共同前行的戰(zhàn)略伙伴，與您一起飛躍，共同成功!