大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整注射麻zui后仰臥固定。胸腹部消森并分離胸主動(dòng)脈，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，以無(wú)菌的冷Hank液漱朱洗血.同時(shí)剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白，取出雙shen冰浴保存。

(2)shen小球分離:參照Green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm"的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過(guò)80.120和200目鋼篩。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培養(yǎng)；將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。

細(xì)胞生物學(xué)服務(wù)

  南京英瀚斯生物科技公司自建有標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)房，配備有生物安全柜、超凈工作臺(tái)、細(xì)胞三氣培養(yǎng)箱、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、體視鏡、、流式細(xì)胞儀等設(shè)備。細(xì)胞組技術(shù)人員畢業(yè)于東南大學(xué)、華中科技大學(xué)等高校生物學(xué)相關(guān)**，具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握細(xì)胞學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可開(kāi)展多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，細(xì)胞，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個(gè)細(xì)胞，進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無(wú)法與G1期區(qū)分，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞開(kāi)始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開(kāi)始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測(cè)方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過(guò)夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過(guò)程發(fā)生在之前，感受態(tài)細(xì)胞，檢測(cè)PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來(lái)識(shí)別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來(lái)區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測(cè)圖；B 細(xì)胞凋亡檢測(cè)圖

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