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納米顆粒,由于其在DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的保護(hù)能力,在不久的將來可以用作轉(zhuǎn)基因的非病毒載體。通過將納米粒子與許多不同的配體和化合物連接來修飾納米粒子,有助于改善它們在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸。將納米顆粒靶向到細(xì)胞內(nèi)的特定位置,配子和胚胎,可以通過磁轉(zhuǎn)染來實(shí)現(xiàn)。盡管與市售的用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑相比,使用納米顆粒轉(zhuǎn)染具有相當(dāng)?shù)男屎透偷募?xì)胞毒性,但仍需要證明以這種方式傳遞DNA會導(dǎo)致體內(nèi)相似水平的基因表達(dá),特別是考慮到該技術(shù)可能導(dǎo)致副作用。基于病毒的轉(zhuǎn)染,或者更具體地稱為轉(zhuǎn)導(dǎo),涉及使用病毒載體將特定的核酸序列帶入宿主細(xì)胞。山西Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑
化學(xué)轉(zhuǎn)染的效率在很大程度上取決于幾個(gè)因素,如使用的試劑類型、靶細(xì)胞的來源和性質(zhì),以及選擇的比較好DNA與試劑比例。慢病毒等病毒載體能夠攜帶大尺寸的核酸,并將其靶標(biāo)傳遞給非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞,因此在基因***中非常有用。有幾個(gè)因素已被證明可能影響病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率,如靶細(xì)胞類型、使用的啟動(dòng)子類型、載體濃度和使用的轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)條件。在一項(xiàng)評估使用人類免疫缺陷病毒(HIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體外研究中,觀察到這兩種病毒在來自人類、倉鼠、貓、狗、馬和豬的不同細(xì)胞系上的不同程度的效率。在大多數(shù)細(xì)胞類型上,使用HIV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率普遍優(yōu)于EIAV,而這兩種病毒對嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的***性較弱。在同一項(xiàng)研究中,啟動(dòng)子的類型也被認(rèn)為是可能影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的一個(gè)因素,因此含有替代CMV啟動(dòng)子的內(nèi)部啟動(dòng)子EF-1a的HIV在小鼠和大鼠細(xì)胞上表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。湖北西安轉(zhuǎn)染試劑納米顆粒,由于其在DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的保護(hù)能力,在不久的將來可以用作轉(zhuǎn)基因的非病毒載體。
流式細(xì)胞術(shù)可以更精確地定量表達(dá)特定熒光基因的細(xì)胞,以評估轉(zhuǎn)染效率。另一種評估轉(zhuǎn)染效率的方法是通過監(jiān)測轉(zhuǎn)染后的特定蛋白表達(dá)。將轉(zhuǎn)基因引入細(xì)胞可能會改變由轉(zhuǎn)基因或細(xì)胞中其他基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。同樣,轉(zhuǎn)染小RNA也可以調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中特定下游遺傳靶點(diǎn)的表達(dá)。免疫印跡和免疫熒光染色可用于評估轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)的變化。在這兩種方法中,使用特異性抗體結(jié)合靶蛋白是至關(guān)重要的,后者需要使用與一抗結(jié)合的熒光標(biāo)記二級抗體來檢測感興趣的蛋白質(zhì)。另一方面,在免疫印跡中,可以使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗與一抗結(jié)合,進(jìn)行特異性蛋白檢測。免疫印跡法允許對蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行半定量,而免疫熒光染色法允許通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量檢測。通過檢查特定蛋白表達(dá)來評估轉(zhuǎn)染效率更具可重復(fù)性和直接性。然而,使用抗體所固有的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合問題和獲得假陰性結(jié)果的可能性,這可能是由于不及時(shí)測定蛋白質(zhì)表達(dá)引起的,仍然是使用這些方法的缺點(diǎn)。
脂質(zhì)顆粒的加入導(dǎo)致內(nèi)體DNA釋放增加。Delgado等人通過在腎細(xì)胞中添加魚精蛋白,設(shè)法提高了固體脂質(zhì)納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率,但與不添加魚精蛋白的對照組相比,相同的多功能單元,DNA/魚精蛋白/SLN(固體脂質(zhì)納米顆粒),降低了HEK 293細(xì)胞系(人胚胎腎細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染效率。這給了我們希望,通過加入必要的配體的可能性,使用納米顆粒的轉(zhuǎn)染可能會調(diào)整到給定的細(xì)胞類型。Bahrami et al.經(jīng)表明,不同種類的納米顆粒以不同的方式與細(xì)胞膜結(jié)合。形成這些鍵的差異取決于它們的球形或非球形形狀,也取決于不同納米顆粒所表現(xiàn)出的各種粘附電位以及它們進(jìn)入后引起的膜形狀變化。Prabha等人的實(shí)驗(yàn)表明,納米顆粒的大小對COS-1(非洲綠猴腎細(xì)胞)和HEK 293細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率有***影響:使用較小的納米顆粒時(shí),轉(zhuǎn)染效率分別是使用較大納米顆粒的27倍和4倍。在兩種分散體中,小顆粒和大顆粒的細(xì)胞攝取、表面電荷和DNA釋放是相同的,這表明使用納米顆粒進(jìn)行基因傳遞的效率受到許多因素的影響,它們的使用應(yīng)該根據(jù)細(xì)胞類型和應(yīng)用條件進(jìn)行具體調(diào)整。此外,用作納米顆粒分散劑的不同物質(zhì),如十六種不同類型納米顆粒的豬肺表面活性劑和牛血清白蛋白,對其在溶液中的團(tuán)聚有***影響。隨著寡核苷酸生物合成產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,不同類型的修飾寡核苷酸也被引入市場,以提高小RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的效率。
選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑可能取決于幾個(gè)因素,包括轉(zhuǎn)染核酸的類型和轉(zhuǎn)染的復(fù)雜性(單轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染)。一些試劑如Effectene和TransIT-X2是專門用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的,而一些試劑如Lipofectamine RNAiMAX更適合于小寡核苷酸的轉(zhuǎn)染。哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞由于其有限的壽命和有限的擴(kuò)增能力,通常比其他細(xì)胞類型更不容易受到轉(zhuǎn)染。非脂質(zhì)體試劑在轉(zhuǎn)染人原代細(xì)胞方面優(yōu)于脂質(zhì)體試劑,包括PEC、HASMC和HAEC、人原代成肌細(xì)胞和AGS。相比之下,據(jù)報(bào)道,基于脂質(zhì)體的試劑(如Lipofectamine和DharmaFECT家族)在轉(zhuǎn)染其他原代人細(xì)胞(如原代臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和BM-MSC方面比非脂質(zhì)體試劑產(chǎn)生更高的轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)復(fù)合物(CLNACs)通過網(wǎng)格蛋白參與的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。湖北西安轉(zhuǎn)染試劑
用二乙基氨基乙基修飾,右旋糖酐鏈的酰胺化很容易被質(zhì)子化,這使得它可以自組裝成帶負(fù)電荷核酸的納米顆粒。山西Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑
在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒通常含有二核苷酸頻率為1:16的CpG基序,這與細(xì)菌DNA中的頻率相似。CpG免疫刺激的兩個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是疫苗接種和腫瘤免疫***。許多出版物表明,免疫刺激CpG基序可以用于疫苗接種策略,包括給藥編碼抗原的pDNA載體或給藥抗原本身。通過不同的給藥途徑給藥含CpG的脂叢可以抑制**生長。這些結(jié)果來源于使用表達(dá)促炎細(xì)胞因子(如IL-12)的轉(zhuǎn)基因或甚至不含外源轉(zhuǎn)基因的載體的研究。**的生長抑制似乎是由CpG基序引起的,因?yàn)檫@些序列的甲基化否定了這種作用。雖然有***效果,但含CpG基序?qū)?*生長的抑制的確切性質(zhì)尚不清楚。產(chǎn)生的細(xì)胞因子對腫瘤細(xì)胞和**脈管系統(tǒng)都有多重作用。一個(gè)恰當(dāng)?shù)睦邮荌L-12的能力,在響應(yīng)含CpG基序時(shí)產(chǎn)生,引發(fā)抗血管生成反應(yīng)。其他細(xì)胞因子,如IFN-g(自身為CpG誘導(dǎo)的細(xì)胞因子)誘導(dǎo)的細(xì)胞因子,即IP10和Mig,也能夠具有抗血管生成特性。山西Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑
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