ELISA試劑盒的操作方法——間接法

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1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜；

2.次日洗滌3次；

3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌；

4.（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml；

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌；

6.然后用DDW洗滌。

其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

ELISA試劑盒的測(cè)試要求

做好對(duì)照

正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)條件的選擇

在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg/ml。

（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

ELISA試劑盒的分類

檢測(cè)抗體及酶結(jié)合物的稀釋度合適(均為1:30), 方便試驗(yàn)操作者準(zhǔn)確地做稀釋工作，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

ELISA試劑盒——會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，或是平行性不好。

a.原因：溫育位置避光不好或受到氣流干擾。

解決辦法： 請(qǐng)確認(rèn)溫育位置既不透光也不透風(fēng)(如抽屜內(nèi))。

b.原因：操作時(shí)間拖太久。

解決辦法：請(qǐng)?jiān)诜椒ㄊ炀毢笤龠M(jìn)行操作。

c.原因：微孔間相互污染。

解決辦法： 加樣品時(shí)，請(qǐng)小心勿濺出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：標(biāo)準(zhǔn)品或酶標(biāo)記物所加入的量不一致。

解決辦法：請(qǐng)使用已校正過(guò)的移液槍，并確保其與吸頭之間有高度密合性。

e.原因：添加樣品或試劑的操作方法不正確。

解決辦法：加樣品或試劑時(shí)，吸頭請(qǐng)勿接觸微孔。

f.原因：洗板過(guò)程發(fā)生問(wèn)題(如管路堵塞、洗完板后未立刻進(jìn)行下一步驟)。

解決辦法：請(qǐng)隨時(shí)監(jiān)控洗板過(guò)程，洗完后立即進(jìn)行下一步驟。