低溫生物菌種——菌種分離方法

組織分離法

先將所需的藥用真菌采集回來(lái)，選取新鮮、個(gè)體大、壯實(shí)、中齡及無(wú)病蟲(chóng)害的子實(shí)體（或菌核、菌索），作為分離用的材料。若為子實(shí)體，取其菌蓋或菌柄組織；若為菌核，取其全部或部分（如茯苓）菌核；若為菌索，取其部分根狀菌索（如蜜環(huán)菌）。再用75 %酒精進(jìn)行表面消毒2 分鐘，用無(wú)菌水（或冷開(kāi)水）沖洗數(shù)次，洗凈殘留的藥液后切成小塊。，然后，放入PDA 培養(yǎng)基的試管或培養(yǎng)皿上，置24 ～26℃溫度下，培養(yǎng)5 ～ 7 天。在分離的真菌組織周?chē)?jiàn)長(zhǎng)有白色菌絲時(shí)，應(yīng)及時(shí)將菌絲移至斜面試管培養(yǎng)基上，再置溫度24 ～26 ℃下培養(yǎng)7～10 天，即得純菌種。所得的純菌種還可繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)或保藏。

低溫生物菌種——常用菌種介紹

側(cè)孢芽孢菌

在延遲期， 短芽孢菌為革蘭氏染色陰性，菌體呈細(xì)長(zhǎng)的桿狀；在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體成短而粗的桿狀；在靜止期，革蘭氏染色又轉(zhuǎn)為陰性，菌體成細(xì)長(zhǎng)的桿狀，偶爾也能觀察到橢圓形的芽孢。圖1是50號(hào)菌用1%H2SO4(pH6.8)負(fù)染后的電鏡照片：菌體桿狀、周生鞭毛、大小約0.88μm×2.2μm。

作為非脊椎動(dòng)物的病原菌，有關(guān)研究人員曾報(bào)道了這種細(xì)菌的殺線蟲(chóng)能力，由于所報(bào)道的這些側(cè)孢短芽孢菌菌株都不產(chǎn)生伴孢晶體，所以這些菌株的殺線蟲(chóng)毒力因子并非來(lái)自于具有特征性的伴孢晶體。然而，Smirnova TA，et al.分離到了2株能形成大的伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢菌菌株，這兩株菌顯示出很強(qiáng)的殺昆蟲(chóng)能力，研究證實(shí)，這種能力與菌體在形成芽孢過(guò)程中的伴孢晶體相關(guān)。有趣的是，Singer的實(shí)驗(yàn)表明，一株側(cè)孢短芽孢菌的殺線活性源于一個(gè)熱穩(wěn)定蛋白的毒性。所有這些研究表明，不同側(cè)孢短芽孢菌菌株擁有不同的線蟲(chóng)致病因子。牛秋紅研究小組分離到的側(cè)孢短芽孢菌G4菌株具有顯著的殺線蟲(chóng)功能，但其并不產(chǎn)生伴孢晶體。從該菌株的發(fā)酵液里提取的粗蛋白酶液在12h內(nèi)能殺掉所有測(cè)試線蟲(chóng)并在24h內(nèi)完全降解。從側(cè)孢短芽孢菌G4菌株中純化出的絲氨酸胞外蛋白酶可水解多種底物，包括膠原和線蟲(chóng)體壁，具有很強(qiáng)的殺線蟲(chóng)能力，組織病理電鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種蛋白酶嚴(yán)重破壞了線蟲(chóng)體壁。而且，蛋白酶將線蟲(chóng)體壁分解成為一些氨基酸或小肽，這些營(yíng)養(yǎng)物使病原細(xì)菌更好的生長(zhǎng)繁殖。該蛋白酶基因異源表達(dá)的菌株表現(xiàn)出了明顯的殺線蟲(chóng)活性，重組蛋白酶在體外對(duì)線蟲(chóng)體壁降解，而蛋白酶缺失菌株喪失了大部分的殺線活性，死的線蟲(chóng)在生測(cè)中保持了完整的體壁，表明蛋白酶在線蟲(chóng)侵染中起主要作用。

生物菌種的優(yōu)點(diǎn)

1、根際環(huán)境保護(hù)屏障：菌群中的地衣芽孢菌等有益微生物施入土壤后，迅速繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群類(lèi)，控制根際營(yíng)養(yǎng)和資源，使重茬、根腐、立枯、流膠、灰霉等病原菌喪失生存空間和條件。使植物根系細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚，纖維化、木質(zhì)化，并生成角質(zhì)雙硅層，形成阻止病原菌侵襲的堅(jiān)固屏障。

2、增強(qiáng)抗逆性：菌群中的地衣芽孢菌、巨大芽孢菌、側(cè)孢芽孢菌等有益微生物可增強(qiáng)土壤緩沖能力，保水保濕，增強(qiáng)作物抗旱、抗寒、抗?jié)衬芰?同時(shí)側(cè)孢芽孢菌還可強(qiáng)化葉片保護(hù)膜，抵抗病原菌侵染，抗病，抗蟲(chóng)。

生物菌種如何才能發(fā)揮出好的效果？

加強(qiáng)環(huán)境調(diào)控 保持菌種活性

有機(jī)肥施入土壤后，必須有微生物發(fā)酵腐熟，才能起到改良土壤，提高土壤透氣性的作用。

當(dāng)前，很多菜農(nóng)高溫悶棚前也使用生物菌劑，但因?yàn)槭褂貌划?dāng)，常常影響悶棚效果，甚至根本沒(méi)有完成糞肥腐熟，蔬菜定植后又出現(xiàn)燒根問(wèn)題，這是怎么回事呢？

這就要從生物菌的特性說(shuō)起。要想生物菌劑發(fā)揮應(yīng)有的作用，首先要確保生物菌存活，并快速增殖達(dá)到一定數(shù)量，才能充分發(fā)揮其作用。因此，菜農(nóng)一定要深入了解生物菌特性，盡量創(chuàng)造適宜生物菌存活的條件。