熒光分光光度計(jì)

熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定， 不但可以做一般的定量分析, 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化， 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍一般是190~650nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍是200~800nm?？捎糜谝后w、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。

熒光分光光度計(jì)的構(gòu)成

1. 光源：為氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm 范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，故較常用。

2．激發(fā)單色器：置于光源和樣品室之間的為激發(fā)單色器或一單色器，篩選出特定的激發(fā)光譜。

3．發(fā)射單色器：置于樣品室和檢測(cè)器之間的為發(fā)射單色器或第二單色器，常采用光柵為單色器。篩選出特定的發(fā)射光譜。

4． 樣品室：通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。測(cè)量液體時(shí)，光源與檢測(cè)器成直角安排；測(cè)量固體時(shí)，光源與檢測(cè)器成銳角安排。

5． 檢測(cè)器：一般用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器。可將光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)為電信號(hào)。

熒光分光光度計(jì)的功能特點(diǎn)

1． 熒光發(fā)射光譜選擇某一固定波長(zhǎng)的光激發(fā)樣品，記錄樣品中產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系，即得熒光發(fā)射光譜。

2． 熒光激發(fā)光譜選定某一熒光發(fā)射波長(zhǎng)記錄熒光發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)光波長(zhǎng)的函數(shù)，即得熒光激發(fā)光譜。

3．時(shí)間分辨技術(shù)；可用于對(duì)混合物中光譜重疊但有壽命差異的組分進(jìn)行分辨并分別測(cè)量。時(shí)間分辨熒光測(cè)定公式如下：P(t) = P0 EXP (-t /τ)式中P(t)：擬合指數(shù)函數(shù)P0：強(qiáng)度取值EXP：指數(shù)運(yùn)算符t：時(shí)間取值τ：熒光平均時(shí)間壽命

熒光分光光度計(jì)測(cè)試注意事項(xiàng)

①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。

②在熒光分析時(shí)，為了得到穩(wěn)定且可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時(shí)間可以縮短到10min左右。對(duì)某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長(zhǎng)波長(zhǎng)、低人射光強(qiáng)度及短時(shí)間光照。

③溫度變化可引起熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量的子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測(cè)試溫度變化不超過±3℃，對(duì)測(cè)試結(jié)果幾乎無(wú)影響。

④當(dāng)熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會(huì)發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。

⑤分子結(jié)構(gòu)中存在π-π共軛的熒光物質(zhì)在極性溶劑中，熒光效率顯著增強(qiáng)。溶液中表面活性劑的加入能夠顯著提高熒光強(qiáng)度。

⑥瑞利散射和拉曼散射是溶劑的兩種散射光，應(yīng)注意不要誤把瑞利散射和拉曼散射光譜當(dāng)做熒光光譜。瑞利散射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，拉曼散射與激發(fā)光波長(zhǎng)不同，而熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，因此可以通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)將拉曼散射光與熒光分開。在測(cè)試時(shí)選擇合適的狹縫寬度，或者空白扣除，也可以對(duì)散射光的影響進(jìn)行校正。

⑦熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。

⑧測(cè)試過程中注意不要肉眼盯著氙燈光源看，以防眼睛造成損傷。

⑨儀器房應(yīng)注意經(jīng)常通風(fēng)，避免產(chǎn)生的臭氧在室內(nèi)富集。