自噬流檢測

自噬是調節(jié)真核細鵬生長、和能量代謝的重要生物學機制。細胞自噬行使其生物學功能的前提是自噬流的話化。大量證據表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關疾病研究領域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。ES細胞具有的這種能力在體外增殖并保持未分化狀態(tài)及其多向分化潛能的生物學特性,使其廣泛應用于生物學研究的各個領域,它的潛在醫(yī)學應用價值已成為世界范圍內研究的熱點。因此往需要精細的突驗才能準確判斷自啦流狀態(tài)。

血管生成技術

一、服務介紹

zhong瘤血管生成是一個極其復雜的過程，一般包括包括血管內皮基質降解、內皮細胞移行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。由于zhong瘤組織這種新生血管結構及功能異常，且血管基質不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細胞不需經過復雜的侵襲過程而直接穿透到血管內進入血流并在遠隔部位形成轉移。細胞沉淀用15mlMEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細血管性血管的生長。無論原發(fā)性zhong瘤還是繼發(fā)性zhong瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會有血管生成。25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數，用含20%胎牛血l清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度至1x106細胞/L。這是由于zhongt瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免yi檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數量。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。

Q:中可能出現的沉淀物是什么？

A:基于多年的實驗研究，用于細胞培養(yǎng)的胎牛以及其它中可能會存在以下種類的沉淀物：

（1）纖維蛋白，它是經常出現的較大的沉淀物，可以達到 1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當經過的過濾分裝后，就會在瓶中凝結出現纖維蛋白沉淀。共培養(yǎng)-定時間后進行破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進一步采用RT-PCR對破骨細胞標志酶基因基質金屬蛋白酶。

（2）磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使出現渾濁，并且在 37℃ 培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點， 這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經常被誤認為是微生物污染。

（3）膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質。他們也是中出現沉淀物的常見原因。