免yi共沉淀（Co-IP檢測）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用也被保留下來。用預(yù)先固化在beads上的蛋白質(zhì)A的抗ti免yi沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來，再通過蛋白變性分離，對B蛋白進(jìn)行檢測，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生jia基化的胞嘧定被轉(zhuǎn)化為尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不變。

動物組織細(xì)胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。外顯子測序外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進(jìn)行高通量測序，它能夠以相對低的費(fèi)用對人類外顯子組進(jìn)行拷問。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。

17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。