自噬(autophagy)是細胞受到刺激后吞噬自身的細胞質或細胞器，終將吞食物在溶酶體內(nèi)降解的過程,自噬體(autophagosome)為雙層膜包被的圓形或橢圓形結構,內(nèi)含細胞質、長壽蛋白質和異常蛋白聚集物，損傷或多余細胞器如線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)和微體、

病毒和細菌等。單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC是一種熒光色素，是嗜酸性染色劑，通常被于檢測自噬體形成的特異性標記染色劑,其檢測激發(fā)濾光片波長355nm ,阻斷濾光片波長512nm。Leagene MDC染色液適用于培養(yǎng)細胞的自噬染色，可與EB合用雙染。目前有多種分選人、小鼠、大鼠以及非人類靈長類細胞的MACS直標微珠可供選用。

流式細胞分選

流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒,測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度,從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的--種現(xiàn)代細胞分析技術，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強度和波長將發(fā)光顆粒亞群分開并可實現(xiàn)單ke隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離,單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行超高速分選純化、高通量單分選或細胞芯片制備。分選后的細胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細胞PCR擴增或原位雜交等，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標細胞的高回收率。在長滿的細胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中，沿著中線使用移液器槍頭或者其他硬物劃1-3條平行的直線，去除中線的細胞，細胞在0h、12h、24h后，觀察細胞往中線遷移情況，判斷細胞遷移能力。

細胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

霉菌污染

正常情況下，培養(yǎng)基在 37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質。一旦出現(xiàn)絮狀雜質，顯微鏡下可見絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細胞仍在生長，但它們的生命狀態(tài)會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養(yǎng)箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉移所有細胞，并立即使用 guo 氧擦拭培養(yǎng)箱，包括層板和內(nèi)壁。將 guo 氧放在培養(yǎng)箱中一小時，使蒸汽擴散，待 guo 氧氣味消散后，將細胞轉移到培養(yǎng)箱中。值得注意的是，培養(yǎng)箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節(jié)。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續(xù)擦拭培養(yǎng)箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。自噬流檢測自噬是調(diào)節(jié)真核細鵬生長、和能量代謝的重要生物學機制。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

線菌素 D 或青鏈。一旦被污染，就不可能恢復，即使使用上述，也沒有什么區(qū)別。對于支原體污染的細胞培養(yǎng)，選擇是丟棄污染的培養(yǎng)物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，消毒環(huán)境。如果所有的細胞都被污染了，那可能是整個培養(yǎng)系統(tǒng)污染了。因此，必須對培養(yǎng)基和實驗設備進行檢查。)4、MDC(Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規(guī)范。

選擇實驗外包公司需要注意哪些事項？

技術支持

盡量有專門的技術負責對接項目，或者有技術服務群。隨時溝通項目問題，定期匯報實驗進展。這樣能把控實驗進度，結果數(shù)據(jù)有疑問也可以交流，不要實驗做完就沒人管了。

實驗數(shù)據(jù)

明確提供實驗原始數(shù)據(jù)、原始圖片，并有保密協(xié)議不外傳數(shù)據(jù)和客戶的信息。確保實驗結果的完整性、唯獨性、真實性。這也是找實驗外包很關心的原則。另外結果盡量有實驗報告形式，包含所用材料、實驗步驟和結果統(tǒng)計分析，方便寫文章時直接使用。另外實驗都是有不確定性的，如果外包公司能保證一定能做出預期的結果，那多半是不靠譜的。調(diào)亡I期(pro-apoptosisnuclei)的細胞核內(nèi)染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitati)的空泡結構。做實驗不怕出問題，的外包公司會負責到底，有問題反饋再處理就好。