miRNA測(cè)序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。(1)加入12μ1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。microRNA通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測(cè)序技術(shù)。CmRNA相對(duì)表達(dá)量變化從圖中可以擴(kuò)增曲線可以看出目的RNA擴(kuò)增效果，溶解曲線可以看出引物識(shí)別特異性情況，通過(guò)使用ΔΔCt方法計(jì)算可以得到每個(gè)組中目的mRNA表達(dá)變化?；诘诙鷾y(cè)序技術(shù)的miRNA測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬(wàn)條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。

通?；钚匝蹶?yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無(wú)培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶?yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

2.、檢測(cè)

對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。

5.長(zhǎng)可以合成多長(zhǎng)的引物？

答：引物越長(zhǎng)，出現(xiàn)問(wèn)題的概率就越大。過(guò)程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。有的公司合成過(guò)120base的引物，產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長(zhǎng)度不要超過(guò)80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)（還不一定正確）引物的百分比不會(huì)超過(guò)40%，后續(xù)處理還有丟失很多，的產(chǎn)量很低。

6.需要合成多少OD數(shù)？

答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。1QPCRbuffer5μldNTPmix(2mM)4μl引物1(10pM)μl2引物2(10pM)2μlTaq酶(2U/ul)1μlDNA模板(50ng-1μg/μl)1μl加ddH2O至μl50視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長(zhǎng)，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長(zhǎng), 全長(zhǎng)得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實(shí)也是對(duì)社會(huì)資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺(jué)得需要重復(fù)多次才能成功。