ELISA 是一種結(jié)合抗原、抗ti特異性反應(yīng)和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學(xué)實驗技術(shù)。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗ti既保留其免yi學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應(yīng)，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗ti，通過反應(yīng)使其結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

DNA測序檢測

1. PCR測序反應(yīng)

(1)取0.2ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑:

所加試劑測定模板管標(biāo)準(zhǔn)對照管

BigDye Mix

1μl

待測的質(zhì)粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf ( )雙鏈DNA

-1μ1

待測DNA的正向引物

M13(-21)引物- 1μ 1

滅菌去離子水

2μ 1

總反應(yīng)體積5μ 1,不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

(2)將PCR管置于9600或2400型PCR儀.上進(jìn)行擴(kuò)增。98C變性2min后進(jìn)行PCR循環(huán)，

PCR循環(huán)參數(shù)為96C 10s， 50C 5s， 60°C4min， 25 個循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4C保溫。

2.乙醇法純化PCR產(chǎn)物

(1) 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C離心30 min,小心棄上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗滌沉淀2次。12 000r/min 于4C離心5min,小心棄上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。

(1)加入12μ 1的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

(2)將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2ml PCR管中，稍離心。

(3)在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95C 2min),冰中驟冷，待_上機(jī)。

4..上機(jī)操作按儀器操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動灌膠和建立

運行的測序順序文件。

5.儀器將自動進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測序序列已知，可通過

序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。

6.測序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。

蛋白質(zhì)定量組學(xué)服務(wù)

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組豐度的動態(tài)變化對不同生命過程有重要影響。腺病毒包裝原理介紹腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個殼粒呈二十面體排列構(gòu)成。例如在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，常常伴隨著某些蛋白質(zhì)的表達(dá)異常。目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要分為標(biāo)記(label)策略和非標(biāo)記的(label free)定量策略，其中標(biāo)記策略又分為體內(nèi)標(biāo)記(如 SILAC、15N 標(biāo)記)，以及體外標(biāo)記(如 iTRAQ、TMT 標(biāo)記) 。

傳統(tǒng)的基于2D雙向凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)組通常可以鑒定出約1000種蛋白，對全蛋白質(zhì)組的覆蓋僅在5~10%左右，不能滿足高通量定量蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析的要求。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗ti既保留其免yi學(xué)活性，又保留酶的活性。我們結(jié)合樣品制備與高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，可在細(xì)胞與組織類樣品中鑒定直至多于10000個蛋白，對全蛋白質(zhì)組的覆蓋>60%。結(jié)合生物信息學(xué)分析，為您構(gòu)建高通量蛋白質(zhì)定量表達(dá)譜。

RNA提取及注意事項

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時，需要從組織或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實驗的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1.

Trizol試劑含有，具有毒性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)。

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特別結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。