平板克l隆形成實驗基本步驟::

1、取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。置37團5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的數(shù)。后計算形成率。形成率= (數(shù)/接種細胞數(shù)) x100%平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。公司先后獲得“江蘇省民營科技企業(yè)”、“江蘇省科技型中小企業(yè)”、“江蘇省專精特新中小企業(yè)”等榮譽資質(zhì)，連續(xù)多年被評為“東南大學國家大學科技園企業(yè)”。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

BrdU染色原理

 BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進入子細胞中BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。2、間接磁性細胞標記(Indirectmagneticcelllabeling)(磁珠結(jié)合不需要的細胞,游離于磁場的細胞為所需細胞)間接磁性細胞標記需要聯(lián)合使用單ke隆或者多ke隆抗ti和MACS間標微珠。

注射或細胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。因組織細胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應，需經(jīng)解鏈使Brdu暴露方能被染色。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標抗小鼠IgG孵育、



呈色，顯示進入S期細胞的情況。

細胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

支原體污染

支原體是隱蔽的污染物，不能通過過濾去除。顯微鏡下沒有任何可見的支原體污染跡象，比如細胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴重污染的培養(yǎng)基中），這樣就會導致我們產(chǎn)生錯誤的安全感。而在牛中，支原體是常見的微生物之一。

解決方法：通常的過濾滅菌方法對支原體沒有影響。電鏡形態(tài)學觀察法是一種比較經(jīng)典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。細胞一旦被支原體污染，特別是對重要的細胞系，必須去除支原體，一般的方法有、抗和抗與補體聯(lián)合。值得注意的是，支原體很突出的結(jié)構特征是沒有細胞壁。因此，它對作用于細胞壁的生物合成（如 β-內(nèi)酰胺類、萬古等）完全不敏感，并且通常對多粘菌素、利福平和類具有耐藥性。相反，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類對支原體的抑制作用很強，而氨基糖苷類和氯的抑制作用較弱。

細胞凍存有哪些注意事項？

細胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是的。

細胞凍存的步驟：

配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的凍存培養(yǎng)液;

取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗。

去除 PBS，加入適量胰蛋白酶 (覆蓋培養(yǎng)皿表面) 把單層生長的細胞消化下來;

離心 1000rpm，5min;

去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的終密度為 5×106/ml~1×107/ml;

將細胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;

在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者;

凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。