血管生成技術(shù)

一、服務(wù)介紹

zhong瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個(gè)階段的DNA分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各個(gè)期的百分含量。由于zhong瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫liu細(xì)胞不需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的侵襲過(guò)程而直接穿透到血管內(nèi)進(jìn)入血流并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移。

血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細(xì)血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細(xì)血管性血管的生長(zhǎng)。大鼠gu髓間充質(zhì)gan細(xì)胞的分離操作方法(1)取SD大鼠(2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。無(wú)論原發(fā)性zhong瘤還是繼發(fā)性zhong瘤，一旦生長(zhǎng)直徑超過(guò)1~2 mm，都會(huì)有血管生成。這是由于zhongt瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成。

大鼠shen小球內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.原代細(xì)胞培養(yǎng):(1)shen臟原位灌洗:SD大鼠用25%烏拉坦腹整注射麻zui后仰臥固定。血管生成（Angiogenesis）是指源于已存在的mao細(xì)血管和毛xi血管后微靜脈新的mao細(xì)血管性血管的生長(zhǎng)。胸腹部消森并分離胸主動(dòng)脈,以無(wú)菌的冷Hank液漱朱洗血.同時(shí)剪破shen靜脈利于液體流出。1-2min后shen臟色澤變白,取出雙shen冰浴保存。

(2)shen小球分離:參照Green等方法改進(jìn)。將灌洗后的shen臟撕下shen被膜.去除髓質(zhì)后將皮質(zhì)剪成約1-2mm'的碎塊，輕碾shen皮質(zhì)依次通過(guò)80.120和200目鋼篩。收集shen小球。

(3)shen小球消化和培養(yǎng)；將提取的shen小球加人0.1% IN 型膠原酶消化后收集沉淀。以2x10* 的shen小球數(shù)接種于鋪有1%明膠培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),加A配制好的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰島素/ml.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子20 ng /ml、肝素鈉100 u/ml.青莓su100 U/ml、鏈霉su100 μ/ml) .靜止培養(yǎng)3 d后逐日觀察shen小球的貼壁情況。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。待shen小球充分貼壁后常規(guī)換液.第3同進(jìn)行純化。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法

黑點(diǎn)污染

黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴(kuò)散。它們?cè)诘捅剁R下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑點(diǎn)。在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到核固縮、質(zhì)濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現(xiàn)象。培養(yǎng)液也不渾濁，一般影響較小，因此細(xì)胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，運(yùn)動(dòng)物體無(wú)明顯增加，培養(yǎng)基的顏色和透明度無(wú)明顯變化。在同一批培養(yǎng)的細(xì)胞中也可以發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

解決方法：黑點(diǎn)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞增殖后會(huì)自然消失，因此除了置換外，無(wú)需特殊處理。如果細(xì)胞可能被小的運(yùn)動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養(yǎng)皿細(xì)胞密度，以提高細(xì)胞存活率。

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的。我們培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)不常規(guī)使用，因?yàn)檫B續(xù)使用會(huì)促進(jìn)耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細(xì)胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強(qiáng)烈建議好使用細(xì)胞提供機(jī)構(gòu)或細(xì)胞庫(kù)推薦的生長(zhǎng)培養(yǎng)液。有些細(xì)胞可能會(huì)適應(yīng)在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在做好保種的條件下，可以分出部分細(xì)胞做測(cè)試。