轉(zhuǎn)錄組測序

轉(zhuǎn)錄組即某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的RNA的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。MiRNA是一類可以通過RNAi機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性小RNA，人工miRNA與shRNA的設(shè)計(jì)原理基本相同，由于miRNA具有內(nèi)源性，因此其更易產(chǎn)生有效的基因沉默。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時(shí)間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長時(shí)期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不相同的。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是指利用第二代高通量測序技術(shù)進(jìn)行cDNA測序，快速地獲取某一物種特定qi官或組織在某一狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本。相對于傳統(tǒng)芯片而言，RNA-Seq無需預(yù)先設(shè)計(jì)探針，即可對物種的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，能夠提供較的數(shù)字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的良好工具。

蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進(jìn)行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/mL,否則會(huì)造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對凝膠進(jìn)行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。甲l基化特異性的PCRHerman等（1996）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進(jìn)行分析。分析按照軟件廠商提供的說明書進(jìn)行。以zui小點(diǎn)面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點(diǎn)。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個(gè)重復(fù)具有相同趨勢，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點(diǎn)的相對一致性，至少2個(gè)重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定服務(wù)

蛋白質(zhì)（protein）是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物和生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。由于應(yīng)用各種性質(zhì)的微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、新陳代謝、抵御外來物質(zhì)入l侵及控制遺傳信息等方面都起著重要的作用。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是氨基酸序列，通過鑒定氨基酸序列來匹配它的蛋白質(zhì)，這是定性研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要技術(shù)之一。

質(zhì)譜一般由離子源、質(zhì)量分析器（Mass analyzer）和離子檢測器（Detector）三部分組成。有絲分裂過程中DNA鏈之間的錯(cuò)配引起的fu制滑動(dòng)被認(rèn)為是導(dǎo)致STR產(chǎn)生的較為常見原因，并且依據(jù)不同fu制單元大小的不同以及不同物種之間，fu制滑動(dòng)發(fā)生的概率也不相同。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)等，質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的途徑。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是：以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心，對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。

蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本原理是用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段混合物，經(jīng)MAILDI或ESI等軟電離手段將其離子化，然后通過質(zhì)量分析器將具有特定質(zhì)核比的肽段離子分離開來。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平，簡便，經(jīng)濟(jì)且敏感性高。通過實(shí)際譜圖和理論上蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶消化后產(chǎn)生的一級質(zhì)譜峰圖和二級質(zhì)譜峰圖進(jìn)行的比對，進(jìn)行蛋白鑒定。

高l效液相色譜法檢驗(yàn)方法

高l效液相色譜法是一種現(xiàn)代液體色譜法，其基本方法是將具一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶液作為流動(dòng)相，用高壓輸液泵將流動(dòng)相注入裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各成分先后進(jìn)入檢測器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜圖或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到測定結(jié)果。轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組即某個(gè)物種或特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下產(chǎn)生的RNA的總和，是研究細(xì)胞表型和功能的一個(gè)重要手段。由于應(yīng)用各種性質(zhì)的微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。

高l效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品的分析測定，特別是多組分藥品的測定、雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測定。-般:在93°C預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93°C40s→58°C30s→72°C60s,循環(huán)30-35次，后在72°C保溫7min。有的藥品需要在色譜分離前或后經(jīng)過衍生化反.應(yīng)，方能進(jìn)行分離或檢測。常用的色譜柱填充劑有硅膠用于正相色譜;化學(xué)鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團(tuán)不同可用于反相或正相色譜，其中常用的是十八烷基硅l烷(又稱ODS)鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。