微生物計數(shù)

3.濾膜法

濾膜法是當樣品中菌數(shù)很低時，可將一定體積的湖水、海水或飲用水燈樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積上)的細菌數(shù)。

此法也可以通過培養(yǎng)觀察形成的菌落數(shù)來推算樣品中的菌數(shù)。例如測定飲用水中大腸gan菌的數(shù)目:將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上大腸gan菌的菌落呈現(xiàn)黑色，可根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸gan菌的數(shù)目。金黃色葡萄qiu菌(Staphylococcusaureus)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄qiu菌屬(Staphylococcus)，有"嗜肉菌"的別稱，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起許多嚴重gan染。

此法也是統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目。

4.比濁法

原理是在一定范圍內(nèi)，菌是懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可借助與分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確。

5.顯微鏡直接計數(shù)法

在課本生物選修1生物技術實踐P22中“除了上述活菌計數(shù)法外，顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法?！边@里說的顯微鏡直接計數(shù)，我認為應該是在稀釋涂布的基礎上不培養(yǎng)成菌落而通過染色的方法在顯微鏡下直接計數(shù)。再如濾膜法也一樣，可以有兩種情況?！称肺⑸镯椖勘尘啊吃床≡⑸镆鸬氖吃葱约膊∈鞘称钒踩暮诵膯栴}。

另外，微生物計數(shù)法發(fā)展迅速，多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法可以用來統(tǒng)計微生物的數(shù)目。

微生物限度檢查

微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。

   當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時，應按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。

   微生物計數(shù)試驗環(huán)境應符合微生物限度檢查的要求。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期進行監(jiān)測。

   如供試品有抗jun活性，應盡可能去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。

   供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。

4.供試品中微生物的回收

    微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。

   （1）平皿法 平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿，以算術均值作為計數(shù)結果。

   傾注法 取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗jun活性的去除或滅活” 制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應相應增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

   涂布法 取15～20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(mixedculture)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應相應增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備” “接種和稀釋” 和“抗jun活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。

計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.5～2范圍內(nèi)；采用MPN法時，試驗組菌數(shù)應在菌液對照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。

   方法適用性確認時，若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么選擇回收接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。

   供試品檢查

   檢驗量

   檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml或c㎡）。

   一般應隨機抽取不少于2個zui小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。

   除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100c㎡；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時，應從2個以上zui小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。

   供試品的檢查

   按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。

   胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。

   陰性對照試驗 以稀釋液代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長，如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)査。