從動物組織中提取基因組DNA

使用研缽進行勻漿時：

① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的研缽中，快速用力展研成勻漿。注）下列組織請加液氮研磨至粉末狀。

A．富含DNA酶的胰臟、脾1臟、胸腺、淋巴等組織。

B．富含膠原蛋白的皮膚、肌腱等組織。

C．富含角質蛋白的組織或堅硬的組織（如骨骼）等。

② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1，溫和研磨30秒鐘。注）使用上述①-注）的實驗材料時，請在加入Solution A及RNase A1后，將研缽置于65℃水浴上研磨1分鐘。

③ 收集650 μl研磨好的組織勻漿液移至Collection Tube中。如果勻漿體積不足650 μl，請補充Solution A至650 μl，65℃保溫5分鐘。

使用研磨棒進行勻漿時:

① 取1～100 mg的動物組織或人組織移入冰浴預冷的Collection Tube 中，用研磨棒快速研磨成糊狀。

② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成勻漿。

③ 加入350 μl的Solution A將研磨棒上的勻漿沖入Collection Tube中，充分振蕩混合后，65℃保溫5分鐘。

如何確認RNA的質量

實時熒光定量PCR技術是通過測定RNA的轉錄水平來評估基因的活力。RNA樣本提取的質量直接影響基因表達分析。影響RNA品質的因素有以下三種：RNA濃度、RNA純度和RNA完整性。

檢測RNA濃度、純度和完整性的方式主要有以下幾種：

紫外分光光度計法：

測量260nm吸收值計算RNA濃度，測量260nm/280nm吸收值的比值，用于評估RNA純度。需要注意的是：在檢測核酸物質時應該在固定的PH溶液中進行。

260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間。＜1.9，說明有蛋白質殘留；＞2.1，說明RNA可能發(fā)生降解。

瓊脂糖凝膠電泳：

完整的RNA通常有三條帶，zui亮的是28S條帶，其次是18S條帶，zui淡的是5S條帶（部分試劑盒提取時會過濾掉5S條帶）。通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測28S和18S的比值。該方法主要用于檢測RNA的純度和完整性。

如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利，28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量zui好。

若RNA條帶出現彌散，原因可能：RNA被核酸酶降解、電壓或電流過大、上樣量過高或過低等。

核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構成。RNA的堿基主要有4種，即A（腺piao呤）、G（鳥piao呤）、C（胞C4H4N2)、U(尿C4H4N2)，其中，U（尿C4H4N2）取代了DNA中的T。核糖核酸在體內的作用主要是引導蛋白質的合成。

人體一個細胞含RNA約10pg（含DNA約7pg）。與DNA相比，RNA種類繁多，分子量較小，含量變化大。RNA可根據結構和功能的不同分為信使RNA和非編碼RNA。非編碼RNA分為非編碼大RNA和非編碼小RNA。非編碼大RNA包括核糖體RNA、長鏈非編碼RNA。非編碼小RNA包括轉移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA（20~300nt）包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等，細菌也有小分子RNA（50~500nt）。

提取DNA常用的方法

　　一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

　　二.甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

　　三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。

　　四.異丙1醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙1醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在異丙1醇中可溶狀態(tài))

　　五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

　　六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應。

　　七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。