pcr擴增的原理

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留copy原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)1制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)1制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬倍的擴增。

LA PCR的原理

LA PCR的關(guān)鍵是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐熱性DNA聚合酶。在PCR過程中當有錯誤的堿基攝入時，反應(yīng)性能將大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可將錯配的堿基除去，從而延伸反應(yīng)能順利地進行下去，使長鏈DNA的擴增成為可能。

隨機引物擴增技術(shù)(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計或選擇一個非特異性引物.在PCR反應(yīng)體系中.首先在不嚴格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在,則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA部分片段的擴增。經(jīng)一至數(shù)輪不嚴格條件下的PCR循環(huán)后，再于嚴格條件下進行擴增。擴增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測序凝膠電泳分離后.經(jīng)放1射性自顯影或熒光顯示即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫1瘤的抑制基因、癌基因的分離;菌1種、菌株及不同物種的鑒定;遺傳作圖;不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達差異等方面的研究。

競爭性PCR(competitive PCR, c-PCR技術(shù)

c-PCR技術(shù)是競爭cDNA模板與目的cDNA同時擴增.使用同樣的引物,但一經(jīng)擴增后。能從這些目的cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競爭cDNA模板.其序列與目的cDNA序列相同.不過模板中僅有一個新內(nèi)切位點或缺少內(nèi)切位點突變性的cDNA模板可用適當?shù)膬?nèi)切酶水解,并用分光計測定其濃度。cDNA目的序列和競爭模板相對應(yīng)的含量.可用澳化乙錠染色.電泳膠直接掃描進行測定或摻入放1射性同位素標記的方法測定。競爭模板開始時的濃度是已知的.則cDNA目的序列的zui初濃度就能測定。這種方法能準確測定mRNA中cDNA靶序列.可用于幾個到10個細胞中mRNA的定量。