如何評(píng)價(jià)和選擇支原體檢測(cè)試劑盒

1. 靈敏度。

靈敏度常用支原體基因組的拷貝數(shù)或支原體菌株的CFU表示。

2. 特異性和廣譜性。

質(zhì)量好的試劑盒應(yīng)檢測(cè)的支原體物種越多越多，并且特異性強(qiáng)，即只針對(duì)支原體，不針對(duì)其他細(xì)菌等微生物，沒有交叉反應(yīng)。

3. 穩(wěn)定性。

凍干粉比液體試劑的穩(wěn)定性高。

4. 樣本類型及樣本處理。

一款好的試劑盒，會(huì)標(biāo)出它適合的樣本類型，也會(huì)說明如何處理樣本。要注意有的樣本含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，因此需要處理。

5. 對(duì)照品。

一個(gè)好的試劑盒，會(huì)帶有陽性對(duì)照和內(nèi)控對(duì)照。內(nèi)控對(duì)照是用于監(jiān)測(cè)PCR是否正常。如果樣本含有抑制PCR的物質(zhì)，則內(nèi)控對(duì)照的條帶會(huì)發(fā)生缺失。有嚴(yán)重支原體污染的樣本由于樣本中的支原體對(duì)內(nèi)控對(duì)照產(chǎn)生了競爭性抑制，因此支原體條帶越強(qiáng)，內(nèi)控條帶越弱

核糖核酸（縮寫為RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物細(xì)胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經(jīng)磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個(gè)核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu)成。RNA的堿基主要有4種，即A（腺piao呤）、G（鳥piao呤）、C（胞C4H4N2)、U(尿C4H4N2)，其中，U（尿C4H4N2）取代了DNA中的T。核糖核酸在體內(nèi)的作用主要是引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。

人體一個(gè)細(xì)胞含RNA約10pg（含DNA約7pg）。與DNA相比，RNA種類繁多，分子量較小，含量變化大。RNA可根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同分為信使RNA和非編碼RNA。非編碼RNA分為非編碼大RNA和非編碼小RNA。非編碼大RNA包括核糖體RNA、長鏈非編碼RNA。非編碼小RNA包括轉(zhuǎn)移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA（20~300nt）包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等，細(xì)菌也有小分子RNA（50~500nt）。

植物ＤＮＡ的“一管法”提取方法：1 稱取100ｍｇ新鮮植物組織,剪碎置于1 5ｍｌ離心管中,可加入少許無菌石英砂,加入3滴提取緩沖液,用帶玻璃鉆頭的電鉆充分研磨勻漿。2 加入400μｌ提取緩沖液,混勻后置于90℃水浴中,不時(shí)顛倒搖勻。3 溫育20ｍｉｎ后,置于冰浴中5ｍｉｎ,使組織和聚乙烯聚吡咯烷酮(ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ,ＰＶＰＰ)沉淀,置于4℃下保存?zhèn)溆谩?br />

植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：

1 稱取新鮮葉片2-3ｇ,剪碎放入研缽中,在液氮中研磨成粉末。

2 將粉末轉(zhuǎn)移到的加有7ｍｌ經(jīng)預(yù)熱的1 5×ＣＴＡＢ提取緩沖液15ｍｌ離心管中,迅速混勻后置于65℃水浴中,溫育30ｍｉｎ。

3 取出離心管,冷卻至室溫,加入氯1仿/異戊1醇(24:1),充分混勻,室溫下2300×ｇ離心20ｍｉｎ。

4 將上清轉(zhuǎn)移至另一新的15ｍｌ離心管中,加入1/10體積10%的ＣＴＡＢ和等體積的氯1仿/異戊1醇。充分混勻,2300×ｇ離心20ｍｉｎ。

5 轉(zhuǎn)移上清至另一新的15ｍｌ離心管中,加入等體積1%的ＣＴＡＢ沉淀緩沖液,輕輕搖晃至形成ＤＮＡ絮狀沉淀。1000×ｇ離心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。

6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中過夜。待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃預(yù)冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ離心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用離心機(jī)甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超凈工作臺(tái)上吹干。

7 將風(fēng)干的ＤＮＡ直接在4℃保存?zhèn)溆没蛉苡?00μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。