基于基因工程技術(shù)制備小分子特異性antibody

通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小分子的偶聯(lián)物并不是不能產(chǎn)生特異性針對小分子的抗1體，而是效價(jià)過低，不滿足制備多克1隆抗1體和單克1隆抗1體的需要，但是基因工程手段為制備該類型小分子特異性antibody提供了新的思路。該技術(shù)的核心在于制備antibody的基因文庫，通過噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)等獲取antibody的目的基因，再利用蛋白表達(dá)系統(tǒng)制備重組antibody或者改造antibody，以獲取針對小分子的特異性antibody。目前隨著antibody基因測序信息的公布和完善，為人工設(shè)計(jì)antibody提供了基礎(chǔ)，這也會(huì)以后小分子特異性antibody的制備提供了新的途徑。

如何評價(jià)和選擇支原體檢測試劑盒

1. 靈敏度。

靈敏度常用支原體基因組的拷貝數(shù)或支原體菌株的CFU表示。

2. 特異性和廣譜性。

質(zhì)量好的試劑盒應(yīng)檢測的支原體物種越多越多，并且特異性強(qiáng)，即只針對支原體，不針對其他細(xì)菌等微生物，沒有交叉反應(yīng)。

3. 穩(wěn)定性。

凍干粉比液體試劑的穩(wěn)定性高。

4. 樣本類型及樣本處理。

一款好的試劑盒，會(huì)標(biāo)出它適合的樣本類型，也會(huì)說明如何處理樣本。要注意有的樣本含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，因此需要處理。

5. 對照品。

一個(gè)好的試劑盒，會(huì)帶有陽性對照和內(nèi)控對照。內(nèi)控對照是用于監(jiān)測PCR是否正常。如果樣本含有抑制PCR的物質(zhì)，則內(nèi)控對照的條帶會(huì)發(fā)生缺失。有嚴(yán)重支原體污染的樣本由于樣本中的支原體對內(nèi)控對照產(chǎn)生了競爭性抑制，因此支原體條帶越強(qiáng)，內(nèi)控條帶越弱

水中微生物DNA提取試劑盒，樣本制備步驟。

步驟1. 樣本過濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準(zhǔn)備：預(yù)先將恒溫儀設(shè)置到70℃，將恒溫箱設(shè)置到37℃。

2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉(zhuǎn)放置到試劑盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400μl裂解液轉(zhuǎn)移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分鐘。

2.6 樣本短暫離心，并加入400μl Binding Buffer（結(jié)合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請勿離心樣本，并立即進(jìn)行下一步。

步驟3. DNA提取

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800μl）轉(zhuǎn)移到CollectionTube（收集管）內(nèi)的SpinColumn（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000× g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個(gè)新的收集管中。

3.5 zui大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。

3.6 棄掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃預(yù)熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應(yīng)全部覆蓋洗脫液。

3.8 室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9 樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲(chǔ)存在2~8℃，可存放1周。長期儲(chǔ)存是在≤-18℃。

回收產(chǎn)物的檢測

1.紫外分光光度計(jì)法檢測DNA在OD260處有明顯吸收峰，當(dāng)OD260=1時(shí)，相當(dāng)于大約50 ng/μL雙鏈DNA、40 ng/μL單鏈DNA。OD260/OD280≈1.6~1.9時(shí)，說明DNA純度較高。若洗脫時(shí)不用洗脫緩沖液，而是用去離子水，會(huì)使比值偏低，因?yàn)殡x子的存在會(huì)影響吸光度。但不表示純度低。

2.SYBR法檢測取回收產(chǎn)物1 μL，與1 μL SYBR染料混勻，于熒光透1視儀下觀察是否有黃綠色熒光。

3.瓊脂糖凝膠電泳法檢測取回收產(chǎn)物5 μL，與10×Loading Buffer混勻，DNA Marker加5 μL，電泳后凝膠成像觀察。5 μL DNA Marker相當(dāng)于每個(gè)條帶50 ng DNA，觀察目的條帶亮度大致為Marker的兩倍，則大致估算其濃度約為20 ng/μL。