PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因。”但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上分子克1隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。

1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長度的第yi個(gè)PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請了PCR的專1利，

1987年7月28日批準(zhǔn)（專1利號4,683,202 ），Mullis是第yi個(gè)發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學(xué)術(shù)論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2 離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

原位PCR( in situ PCR)技術(shù)

原位PCR綜合了PCR和原位雜交( Insitu hybridization, ISH)的優(yōu)點(diǎn)是一種在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增.再用特異性的探針原位雜交檢測。原位PCR標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定,以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴(kuò)增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)。在原位對特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過細(xì)胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用ISH將其檢出,同時(shí)還可對目的DNA序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。