農(nóng)桿1菌轉(zhuǎn)化法在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用：過去認(rèn)為受農(nóng)bacillus宿主范圍限制，農(nóng)bacillus介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化只限于雙子葉植物。1987年Grimsly首先將玉米條斑病毒的cDNA克1隆至質(zhì)粒上，用農(nóng)bacillus侵染的方法將玉米條斑病毒的cDNA導(dǎo)入玉米，使植株表現(xiàn)了系統(tǒng)感1染癥狀。這個報道有力地證明了農(nóng)bacillus能夠侵染玉米這種單子葉植物。隨著載體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法的改進，農(nóng)bacillus介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化不再局限于雙子葉植物，在一些單子葉植物如水稻、玉米和小麥等重要的農(nóng)作物上也相繼獲得成功。

　　進入20世紀(jì)90年代后，農(nóng)桿1菌轉(zhuǎn)化法在水稻、玉米等重要的農(nóng)作物上取得突破性進展。首先是1991年Gould和Shen等利用農(nóng)bacillus轉(zhuǎn)化玉米莖尖分生組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。1998年Lupotto也實現(xiàn)了農(nóng)bacillus轉(zhuǎn)化玉米的成功，Southern雜交結(jié)果顯示外源基因能夠穩(wěn)定遺傳到下一代。

電1擊法

　　電1擊法基本原理是電脈沖使細胞膜產(chǎn)生可逆性的“微孔”，外源DNA可通過這些微孔進入受體細胞原生質(zhì)體內(nèi)。

　　1985年Fromm等用electric shock法將pat基因?qū)肓擞衩自|(zhì)體，得到了該基因穩(wěn)定表達的愈傷組織。隨著玉米原生質(zhì)體再生技術(shù)的研究取得進展，1988年Rhodes等用electric shock法轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，初步獲得了完整的轉(zhuǎn)基因植株。electric shock法還可以對幼胚、愈傷組織和胚性懸浮細胞系進行遺傳轉(zhuǎn)化。1992年D’Hallum K等以玉米幼胚和愈傷組織為受體，用electric shock法導(dǎo)入neo基因，獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株，并且neo基因能穩(wěn)定地遺傳給后代。1993年Sukhapinda等用electric shock法轉(zhuǎn)化從玉米花粉愈傷組織分離的原生質(zhì)體，將gusA和nptⅡ轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，獲得單倍體轉(zhuǎn)化植株。1994年Laursen等以果膠降解酶處理懸浮細胞系后，通過electric shock法導(dǎo)入bar基因，也獲得了可育的轉(zhuǎn)基因玉米。

　　電1擊法操作簡單，不受宿主限制，在遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的初期得到了較為廣泛的應(yīng)用，但是它的轉(zhuǎn)化效率較低，而且對有壁細胞或組織的轉(zhuǎn)化效果較差。

典型的腺病毒載體系統(tǒng)如：穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細胞293細胞。pCA13/的HCMV IE啟動子－多克1隆位點－SV40 AN（poly A）構(gòu)成外源基因的表達盒，該表達盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其兩端側(cè)翼序列（左側(cè)的1~3bp的ITR，右側(cè)從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包裝信號

φ（194~358bp）；pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分，但是缺失了包裝信號φ、0.5~3.7圖距（mu）部分的E1區(qū)、77.5～86.2mu的E3區(qū)，293細胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen細胞系。pBHG11因為缺失包裝信號及E1區(qū)而不能copy，pCA13帶有包裝信號及E1的側(cè)翼序列，但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組，同樣不能copy。外源目的基因插入pCA13后，與pBHG11共轉(zhuǎn)染，進入293細胞。pCA13與pBHG11在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，同時，293細胞提供E1蛋白，從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野1生型腺病毒相似，具有同樣的感1染力進入靶1細胞的能力，但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代，即進入靶1細胞后病毒不能copy，但可以表達目的蛋白。

腺病毒呈無囊膜的球形結(jié)構(gòu),其病毒粒子在感1染的細胞核內(nèi)常呈晶格狀排列,每個病毒顆粒包含一個36 kb的線性雙鏈DNA,兩端各有一個100~600 bp的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal re-pea,t ITR), ITR的內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號,是病毒包裝所需要的順式作用元件。基因組包含早期表達的與腺病毒copy相關(guān)的E1~E4基因和晚期表達的與腺病毒顆粒組裝相關(guān)的L1~L5基因。

線狀雙股DNA與核心蛋白形成直徑為60~65 nm的髓芯,被包裹于衣殼內(nèi)。衣殼呈二十面體對稱,由252個直徑8~10 nm的殼粒組成,殼粒排列在三角形的面上,每邊6個,其中240個為六鄰體(非頂點殼粒) ,另12個為五鄰體基底(頂點殼粒)。每個六鄰體是六鄰體蛋白的同源三聚體,三聚體的六鄰體分子有一個三角形的塔尖和五面體的基底,塔區(qū)由4個環(huán)構(gòu)成即loop1、loop2、loop3、loop4,基底包含兩個區(qū)域P1、P2區(qū)[3]。六鄰體上的表位(epitope)是診斷不同血1清型的標(biāo)準(zhǔn),它包括哺乳動物腺病毒屬的抗原成分,是病毒體對免1疫選擇壓力zui敏感的部位。

每個五鄰體基底上結(jié)合著1根(哺乳動物腺病毒)或2根(禽腺病毒)長9~77. 5 nm的纖維突起,這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼面伸出,纖維頂端形成頭節(jié)區(qū),纖突有血1清特異性,且含有負責(zé)體外血細胞凝集的種屬特異性抗原決定位點。