PCR循環(huán)參數(shù)

預(yù)變性模板DNA完全變性與PCR酶的完全激1活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激1活時(shí)間為兩分鐘。 

變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 

引物退火：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

引物延伸：引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶zui適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。

循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

zui后延伸在zui后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

原位PCR( in situ PCR)技術(shù)

原位PCR綜合了PCR和原位雜交( Insitu hybridization, ISH)的優(yōu)點(diǎn)是一種在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對(duì)特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增.再用特異性的探針原位雜交檢測(cè)。原位PCR標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定,以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜有一定的通透性,PCR擴(kuò)增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)。在原位對(duì)特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過(guò)細(xì)胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用ISH將其檢出,同時(shí)還可對(duì)目的DNA序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

突變：PCR克1隆的一大優(yōu)點(diǎn)是能夠通過(guò)克1隆將所需突變引入目的基因中，以便進(jìn)行突變研究。在 定1點(diǎn)突變中，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的PCR引物可將堿基置換、刪除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克1隆至質(zhì)粒中的序列上。隨后，含有引入突變的PCR產(chǎn)物通過(guò)自我連接，重新生成環(huán)狀質(zhì)粒，并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

測(cè)序：PCR是為測(cè)序富集模板DNA的一種相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。為保證DNA序列準(zhǔn)確性，強(qiáng)烈建議使用高保真PCR來(lái)制備測(cè)序模板。在 Sanger測(cè)序中，PCR擴(kuò)增片段經(jīng)純化并用于測(cè)序反應(yīng)。使用常用的測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)PCR引物的 5′末端進(jìn)行標(biāo)記，以簡(jiǎn)化測(cè)序工作流程。

         二代測(cè)序 （NGS）中，PCR被廣泛用于構(gòu)建DNA測(cè)序文庫(kù)。在NGS文庫(kù)制備中，DNA樣品通過(guò)PCR反應(yīng)富集（在起始量有限的情況下）并使用adaptor（以及用于多重檢測(cè)的index）標(biāo)記。除了具有高保真度，DNA聚合酶還應(yīng)具有zui小的擴(kuò)增偏好性，從而使測(cè)序文庫(kù)具有高覆蓋度。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個(gè)梯度退火功能。DNA部分片段的擴(kuò)增對(duì)溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過(guò)計(jì)算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內(nèi)，如果用普通PCR儀進(jìn)行研究，需重復(fù)擴(kuò)增很多次，然后做電泳進(jìn)行分析來(lái)確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時(shí)間的同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴(kuò)增。

該儀器主要應(yīng)用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。