PCR循環(huán)參數(shù)

預(yù)變性模板DNA完全變性與PCR酶的完全激1活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書(shū)，一般未修飾的Taq酶激1活時(shí)間為兩分鐘。 

變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 

引物退火：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。

引物延伸：引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶zui適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。

循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過(guò)多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

zui后延伸在zui后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。

PCR出現(xiàn)假陰性

不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及Br乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR）枝術(shù)

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對(duì)稱PCR.在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度.常用50~ 100 1比例。在起初的10~ 15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA.但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后。高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA.

應(yīng)用:可制備單鏈DNA部分片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription, RT- PCR技術(shù)

當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時(shí)。需先通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT - PCR應(yīng)用非常廣泛。無(wú)論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。

修飾引物PCR技術(shù)

為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的.如定向克1隆、定1點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等?？稍谝锏?*-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等。

PCR技術(shù)不僅可用于基礎(chǔ)研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)調(diào)查和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。這些應(yīng)用要求可靠的性能、及時(shí)的靈敏度和嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。因此，所使用的PCR儀和PCR試劑必須符合這些要求和目的。

分子診斷應(yīng)用包括基因檢測(cè)、致癌突變檢測(cè)以及感1染性疾病檢測(cè)。在法醫(yī)學(xué)中，利用 PCR進(jìn)行人類身份鑒定是通過(guò)對(duì)特別的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）進(jìn)行擴(kuò)增而區(qū)分個(gè)體的。在農(nóng)業(yè)學(xué)中，PCR在食物病原體檢測(cè)、育種植物基因分型和 GMO測(cè)試中具有重要作用。