PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下.依賴于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:變性、退火、聚合。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一 循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個(gè)循環(huán)模板,數(shù)小時(shí)后，介于兩個(gè)引物之間的目的DNA得到了大量的copy，經(jīng)25~ 30次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2x1067拷貝數(shù)。

錨定PCR(Anchored PCR. APCR技術(shù).

用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3"-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,稱為APCR.應(yīng)用:它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR術(shù)

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA的部分片段，大小取決于.上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

普通的PCR儀

把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀。

它是由主機(jī)，加熱模塊，PCR管，熱蓋，控制軟件組成。根據(jù)DNA部分片段高溫解鏈，降溫配對(duì)聚合原理，通過循環(huán)改變加熱模塊的溫度，微量不易于分辨的的DNA部分片段進(jìn)行擴(kuò)增成大量的DNA部分片段，從而對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。根據(jù)需要可結(jié)合電泳儀，水平電泳槽，一起應(yīng)用。如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行。主要是做簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。

該儀器主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)，食品檢測(cè)，科研機(jī)構(gòu)，高等院校教學(xué)對(duì)遺傳變異，基因表達(dá)等進(jìn)行研究。

原位PCR儀

它是由主機(jī)，加熱模塊，玻片，熱蓋，控制軟件組成。主要是應(yīng)用對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的DNA部分片段進(jìn)行原位擴(kuò)增分析-即定位分析，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增，不但可以檢測(cè)到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。它無需將細(xì)胞破碎提取DNA，細(xì)胞內(nèi)有DNA酶的作用擴(kuò)增受到一定的影響，使用不是很普遍。

該儀器主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床研究，如癌細(xì)胞等。