動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

高速冷凍離心機(jī)在所有的細(xì)胞離體培養(yǎng)中，困難的是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。下面是它所需要的特殊條件。

⑴血1清：動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)常常需要血1清。相對(duì)常用的是小牛血1清。血1清提供生長(zhǎng)必需因子，如激1素、微量元素、礦物質(zhì)和脂肪。在這里，血1清等于是動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)的天然營(yíng)養(yǎng)液。

⑵支持物：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞有貼壁生長(zhǎng)的習(xí)慣。離體培養(yǎng)常用玻璃，塑料等作為支持物。

⑶氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不斷進(jìn)行調(diào)節(jié)，不斷維持所需要的氣體條件。

環(huán)境條件

無(wú)菌環(huán)境：無(wú)毒和無(wú)菌是體外培養(yǎng)細(xì)胞的首要條件。細(xì)胞在活1體內(nèi)，解1毒系統(tǒng)和免1疫系統(tǒng)可抵抗微生物或其他有害物質(zhì)的侵入，但細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，缺乏機(jī)體免1疫系統(tǒng)的保護(hù)而喪失對(duì)微生物的防御能力和對(duì)有害物質(zhì)的解1毒能力。為保證細(xì)胞能在體外環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，必須要確保無(wú)菌工作區(qū)域、良好的個(gè)人衛(wèi)生、無(wú)菌試劑和培養(yǎng)基以及無(wú)菌操作。

常見(jiàn)的微生物污染有支原體、細(xì)菌、真菌。支原體無(wú)致死毒性，可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，對(duì)細(xì)胞有潛在影響，但體積小，不易鑒別，可借助于地衣紅或Hoechst33342染色來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)菌增殖快，在短時(shí)間內(nèi)即可大量擴(kuò)增，并產(chǎn)生毒1素殺1死細(xì)胞。真菌的種類繁多，肉眼可見(jiàn)，漂浮于培養(yǎng)液面上，可呈絲狀、管狀或樹枝狀等。

細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25?TA的胰蛋白酶，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM完全培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。